En egenbyggd och ljusdiodbaserad fotodynamisk terapiapparat för att förbättra verteporfincytotoxicitet i en 2D-cellodlingsmodell

Summary

Här beskriver vi en ny, enkel och billig enhet för att framgångsrikt utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) analyser med tvådimensionell HeLa-cellodling och verteporfin som fotosensibiliserare.

Abstract

Detta dokument beskriver en ny, enkel och billig enhet för att utföra in vitro fotodynamisk terapi (PDT) -analyser, kallad PhotoACT. Enheten byggdes med hjälp av en uppsättning konventionella programmerbara lysdioder (lysdioder), en LCD-modul (liquid crystal display) och en ljussensor ansluten till ett kommersiellt mikrokontrollerkort. Prototypens lådbaserade struktur gjordes med fiberplattor med medelhög densitet (MDF). Det inre facket kan samtidigt allokera fyra mikroplattor för cellodling multiwell.

Som ett bevis på konceptet studerade vi den cytotoxiska effekten av fotosensibiliseraren (PS) verteporfin mot HeLa-cellinjen i tvådimensionell (2D) kultur. HeLa-celler behandlades med ökande koncentrationer av verteporfin i 24 timmar. Det läkemedelsinnehållande supernatantmediet kasserades, de vidhäftande cellerna tvättades med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och läkemedelsfritt medium tillsattes. I denna studie undersöktes effekten av verteporfin på celler antingen utan ljusexponering eller efter exponering i 1 timme för ljus med hjälp av rödgrönblå (RGB) värden på 255, 255 och 255 (genomsnittlig fluens på 49,1 ± 0,6 J / cm²). Efter 24 timmar bedömdes cellviabiliteten genom analysen 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT).

Experimentella resultat visade att exponering av celler behandlade med verteporfin för ljuset från enheten förbättrar läkemedlets cytotoxiska effekt via en mekanism medierad av reaktiva syrearter (ROS). Dessutom validerades användningen av prototypen som beskrivs i detta arbete genom att jämföra resultaten med en kommersiell PDT-enhet. Således representerar denna LED-baserade fotodynamiska terapiprototyp ett bra alternativ för in vitro-studier av PDT.

Introduction

Bland de mest dödliga icke-överförbara sjukdomarna utgör cancer en globalt ledande orsak till för tidig död. Det stod för nästan 10 miljoner dödsfall 2020, vilket motsvarar ungefär ett av sex dödsfall i världen¹. Dessutom utgör fenomenet multiresistans (MDR) ett enormt hot mot folkhälsan, eftersom godkända kemoterapeutiska protokoll inte når remissionsstadier för detta kliniska tillstånd². Cancerceller kan utveckla resistens mot kemoterapi genom flera mekanismer; Överuttrycket av vissa ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) – ATP-beroende effluxpumpar – anses dock vara den främsta orsaken till MDR-utveckling inom en tumörmikromiljö³. Förutom MDR förstärker andra cancerkomplikationer, såsom återfall och metastasering, den brådskande efterfrågan på att utveckla och förbättra terapeutiska metoder för att övervinna denna onkologiska utmaning.

Det botande utnyttjandet av ljus har praktiserats i århundraden⁴, och fotodynamisk terapi (PDT) representerar ett kliniskt godkänt terapeutiskt tillvägagångssätt för solida tumörer. PDT kombinerar administrering av en fotosensibiliserare (PS) följt av lätt bestrålning för att generera reaktiva syrearter (ROS) för att utöva selektiv cytotoxicitet i tumörceller. Detta terapeutiska tillvägagångssätt är överlägset konventionella metoder, inklusive kirurgi, strålning och kemoterapi⁵; Det är en minimalt invasiv teknik som visar lägre cytotoxicitet i bindväv⁶. Ljusapplikationen och PS-ackumuleringen direkt i tumören eller dess mikromiljö säkerställer exakt inriktning och följaktligen mindre, oönskade systemiska biverkningar⁷ och möjligheten till upprepad behandling på samma plats. Dessutom är kostnaden lägre än för andra tillvägagångssätt. På grund av dess lovande egenskaper kan PDT betraktas som ett lämpligt alternativ för både singel, särskilt vid inoperabla tumörer eller adjuvant cancerbehandling⁷, och representerar ett alternativ för MDR relaterat till kemoterapi ^8,9.

Den första rapporten som visade en hög objektiv svarsfrekvens med PDT beskrevs 1975 i en mus- och råttmodell¹⁰. Sedan dess har studier genomförts med PDT med positiva utfall⁷ både in vivo och in vitro med humana tumörcellinjer i 2D-cellodling^11,12. Med tanke på den breda tillämpligheten av kliniskt godkända PS, oavsett deras specifika ackumuleringsvägar och våglängdsintervall för absorptionstoppar, är den allmänna processen följande: (i) PS-upptag, (ii) toppning av PS-koncentration vid tumören eller dess mikromiljö, (iii) ljusapplikation, (iv) PS-ljusinteraktion, (v) överföring av PS-exciterad tillståndsenergi till antingen vävnadssubstrat eller omgivande syremolekyler, vi) ROS-produktion som involverar singlet syre eller superoxidanjon, (vii) tumörcellsdöd via, i huvudsak, nekros eller apoptos (direkt död), autofagi (cytoprotektiv mekanism), vävnadsischemi (vaskulär skada), immunmodulering eller en överlappning av dessa mekanismer⁷. I detta sista steg beror aktiveringen av en specifik celldödsväg på många faktorer, såsom cellegenskaper, experimentell design och, viktigast av allt, PS intracellulär lokalisering och PDT-relaterad riktad skada¹³.

Verteporfin är en andra generationens PS, godkänd av tillsynsmyndigheter för klinisk användning i Norge och Kina för att behandla åldersrelaterad makuladegeneration⁷. Efter dosleverans rapporterades denna prodrog delvis ackumuleras i mitokondrier¹⁴ och inducera cellulärt proteintyrosinfosforylering och DNA-fragmentering, vilket leder till tumörcellsapoptos^15,16. Efter 24 timmars inkubation för verteporfininternalisering rekommenderas ett PDT-protokoll med en våglängdsinställning på 690 nm för att uppnå effektiva nivåer av elektromagnetisk strålningsöverföring till intilliggande molekyler ^7,17.

När det gäller ljuskällan för PDT är de klassiska diodlassystemen vanligtvis dyra, tekniskt komplicerade, överdimensionerade och därmed oportabla^18,19. Som en följd av dess envåglängdsprofil, som också kan observeras i LED-baserad PDT-utrustning, gör efterfrågan på oberoende enheter för varje fotosensibiliserande applikation användningen av diodlasersystem ännu mer komplex och ekonomiskt omöjlig^20,21. Därför, användningen av LED-maskiner anses vara det mest lovande alternativet för att lösa inte bara kostnader 22 och underhållsproblem, utan också för att ge hög effekt och mindre skadlig²³ och bredare belysningsförmåga^24,25,26,27.

Trots det potentiella bidrag som LED-baserad utrustning kan erbjuda till PDT-experiment²⁸, de flesta kommersiella alternativ har fortfarande nackdelar som brist på bärbarhet, höga kostnader och komplexa byggprojekt och drift²⁹. Huvudsyftet med detta arbete var att erbjuda ett enkelt och pålitligt verktyg för in vitro PDT-analyser. Detta dokument beskriver PhotoACT, en egenbyggd LED-baserad PDT-enhet, som är billig, användarvänlig och bärbar. Som ett bevis på konceptet har denna enhet visat sig förbättra cytotoxiciteten hos verteporfin i en 2D-cellodlingsmodell och kan därför användas som ett forskningsverktyg i PDT-experiment.

Protocol

OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och programvara som används i detta protokoll. 1. Enhetens konstruktion Såg 3 mm tjocka fiberplattor med medelhög densitet (MDF) för att erhålla bitar med måtten som visas i figur 1A.OBS: Använd vektorfilen (Tilläggsfil 1) för datorskärning av numerisk kontroll (CNC). Bygg två lådor med följan…

Representative Results

Den sista PDT-enheten, som heter PhotoACT, inkluderade en mörk kammare för att fördela upp till fyra multiwell-mikroplattor, med sin övre inre yta utrustad med en uppsättning av 30 spridda lysdioder programmerade för att avge distinkta spektrum av synligt ljus (figur 3 och kompletterande fil 6). Enheten byggdes med två tillhörande lådor: en intern låda utformad som en mörk kammare för PDT-analyserna och en extern låda för att täcka den inre kammaren och hålla…

Discussion

Den slutliga PhotoACT-enheten var bekväm att konstruera med kommersiellt tillgängliga, billiga komponenter till en total kostnad på mindre än $ 50. Ytterligare fördelar inkluderar låga underhållskrav, kapacitet att bestråla flera typer av odlingsplattor, samtidig användning av upp till fyra enheter per analys, låg vikt (2 kg) / storlek (44 cm³) som möjliggör bärbarhet, exakt och reproducerbar bestrålning (data visas inte) och ett användarvänligt och enkelt installationsgränssnitt som inte krä…

Materials

0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054	Mammalian cell culture dissociation reagent
3D printer	Flashforge		Finder model
96-well plates			Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture
Arduino
Brightness sensor			TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface
Buttons
Buzzer
Cell culture Flasks			Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes)
Centrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay
CO2 Incubator
Controller board			ESP32
Design Software	Trimble		SketchUp
DMEM High Glucose	Gibco	11965092	DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells.
DMSO	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture
Fetal Bovine Serum	Gibco	12657029	FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages.
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750060	Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination
Hemocytometer			Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay
Inverted Laboratory Microscope	Leica		DM IL LED
Laminar Flow Hood			Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures
LCD display
LED RGB WS2812			5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts
MDF fiberboards			3mm thickness medium-density fiberboards
Microcentrifuge Tubes			Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay
Microplate reader	ThermoFischer		Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation.
MTT Reagent	Invitrogen	M6494	3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays
Operational System	Real Time Engineers ltd.		FreeRTOS
P10 micripipette			Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity
P1000 micropipette			Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity
P200 micropipette			Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity
PDT Equipment	LumaCare		Model LC-122
Phosphate-Buffered Saline pH 7.4	Gibco	10010031	Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures
Potentiometers
Tips			Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes
Verteporfin	Sigma-Aldrich	SML0534-5MG	Verteporfin, ≥94% (HPLC)