Summary

Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Abstract

Candida-Arten sind die vierthäufigste Ursache für systemische nosokomiale Infektionen. Die systemische oder invasive Candidiasis beinhaltet häufig die Bildung von Biofilmen auf implantierten Geräten oder Kathetern, was mit einer erhöhten Virulenz und Mortalität einhergeht. Biofilme, die von verschiedenen Candida-Arten produziert werden, zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antimykotika. Daher besteht die Notwendigkeit, wirksame Immuntherapien oder Zusatzbehandlungen gegen Candida-Biofilme zu entwickeln. Während die Rolle der zellulären Immunität im Anti-Candida-Schutz gut etabliert ist, wurde die Rolle der humoralen Immunität weniger untersucht.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hemmung der Biofilmbildung und -reifung eine der Hauptfunktionen schützender Antikörper ist, und Candida albicans Keimrohrantikörper (CAGTA) haben gezeigt, dass sie das In-vitro-Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans früher unterdrücken. Dieser Artikel skizziert ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Antikörpern auf Biofilmen, die von C. tropicalis gebildet werden. Die Methodik für dieses Protokoll beinhaltet die C. tropicalis-Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiterplatten, die dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, gefolgt von einem 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von Pilzzellen im Biofilm.

Die Spezifität wurde durch geeignete Serumkontrollen, einschließlich Sap2-spezifischem Antikörper-depleted Serum, bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die im Serum immunisierter Tiere vorhanden sind, die Candida-Biofilmreifung in vitro hemmen können. Zusammenfassend liefert dieser Artikel wichtige Erkenntnisse über das Potenzial von Antikörpern bei der Entwicklung neuartiger Immuntherapien und synergistischer oder ergänzender Behandlungen gegen Biofilme während der invasiven Candidiasis. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Introduction

Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen1. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen 2. Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren3. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, und Candida kann oxidativen und osmotischen Stressbedingungen standhalten, indem es die Biofilmbildung induziert4. Biofilme modulieren die Expression von Virulenzfaktoren und Zellwandkomponenten weiter und bilden eine exopolymere Schutzmatrix, die Candida hilft, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen4. Biofilme tragen zur Hefehaftung auf Wirtsgewebe und medizinischen Instrumenten bei5. Daher ist die Biofilmbildung mit einem Vorteil für Hefen verbunden, da Hefezellen innerhalb der Biofilme der Immunantwort des Wirts ausweichen können6. Die Biofilmbildung schützt auch die pathogenen Hefen vor der Wirkung von Antimykotika5. Eine verminderte Empfindlichkeit von C. albicans-Biofilmen gegenüber Amphotericin B wurde von Pierce et al.7,8 nachgewiesen. Darüber hinaus zeigen Biofilme eine antimykotische Arzneimittelresistenz gegen Fluconazol, was die effektive Behandlung der systemischen Candidiasis beeinträchtigt 9,10.

Mikroben haben eine intrinsische Tendenz, an verschiedenen biotischen und abiotischen Oberflächen zu haften, was zur Biofilmbildung führt. Candida albicans, ein dimorpher Pilz, existiert in Hefe- und Hyphenformen, und seine Biofilmbildung wurde in verschiedenen in vitro und in vivo Modellsystemen charakterisiert11. Die Schritte der Biofilmbildung umfassen die Adhäsion von Candida-Zellen am Substrat, die Filamentierung, die Proliferation und die Biofilmreifung11. Zunächst haftet die Hefeform von C. albicans an Substraten, einschließlich medizinischer Geräte und menschlichem Gewebe, gefolgt von der Filamentierung und Proliferation von C. albicans in Hyphen- und Pseudohyphalformen und schließlich der Reifung von Biofilmen, die in die extrazelluläre Matrix11 eingebettet sind. Die Biofilmbildung trägt wesentlich zu den Pathogenesemechanismen von C. albicans bei12. Candida-Arten bilden arzneimittelresistente Biofilme, was ihre Ausrottung schwierig macht13. Eine kleine Untergruppe der C. albicans-Biofilm-produzierenden Population wurde als sehr resistent gegen die Antimykotika Amphotericin B und Chlorhexidin14 beschrieben. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen in Biofilmen im Vergleich zu Hefezellen in der Planktonphase und Proliferationsphase14 eine hohe Resistenz gegen Multidrug-Therapie aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hefezellen, die in Biofilmen vorhanden sind, sehr tolerant gegenüber Antimykotika sind, was zum Überleben von C. albicans in Biofilmen beiträgt14. Es wurde berichtet, dass diese vorhandenen Zellen phänotypische Varianten von C. albicans und keine Mutanten sind14. Darüber hinaus sind Zellen von Candida-Biofilmen, die als “Persister-Zellen” bekannt sind, tolerant gegenüber hohen Dosen der Amphotericin-B-Behandlung und tragen zum Überleben von Candida bei, wodurch eine große Belastung durch wiederkehrende systemische Candida-Infektionen bei Hochrisikopersonen darstellt15.

Die Zunahme der antimykotischen Arzneimittelresistenz bei Candida-Stämmen erfordert die Erforschung neuer Antimykotika und Immuntherapien. Wie aus den oben genannten Studien hervorgeht, zeigen Candida-Biofilme eine verminderte Anfälligkeit für Antimykotika. Daher besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntherapien, um die Bildung von Candida-Biofilmen zu kontrollieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CAGTA einen wirksamen Schutz vor systemischen Candida-Infektionen bieten kann, indem es die Biofilmbildung von C. albicans in vitrohemmt 16. Eine andere Studie berichtete, dass die Immunisierung von Mäusen mit C. albicans rAls3-N-Protein hohe Antikörpertiter induziert, die die Biofilmbildung von C. albicans in vitro17 stören. Anti-Als3-N-Antikörper übten auch eine hemmende Wirkung auf die Ausbreitung von C. albicans aus Biofilmenaus 17. Der NDV-3A-Impfstoff auf Basis von C. albicans befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung und es wurde auch festgestellt, dass Anti-NDV-3A-Seren die Biofilmbildung von C. auris reduzieren18. Eine kürzlich durchgeführte Studie identifizierte die Hemmung der Biofilmbildung durch Sap2-Antikörper als Schutzmechanismus in einem murinen Modell der systemischen Candidiasis19.

Dieser Artikel skizziert ein detailliertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Wirkung von antigenspezifischen Antikörpern, die in polyklonalem Serum aus verschiedenen Gruppen von Sap2-geimpften Mäusen auf vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen vorhanden sind. Um dies zu erreichen, wurde eine auf einem XTT-Reduktionsassay basierende Methode optimiert und im Labor entwickelt, die die Biofilmlebensfähigkeit schnell, empfindlich und mit hohem Durchsatz in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern messen kann.

Der XTT-Assay wird verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität als Indikator für Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zytotoxizität zu messen20. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, Natrium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzolsulfonsäurehydrat (XTT) zu einem orangefarbenen Formazanfarbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Da nur lebensfähige Zellen XTT reduzieren können, ist die Menge an reduziertem XTT-Formazan proportional zur Intensität der Farbe und Zelllebensfähigkeit. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich und wird direkt mit einem Plattenleser quantifiziert. Aufgrund seiner wasserlöslichen Natur ermöglicht der XTT-Assay die Untersuchung intakter Biofilme sowie die Untersuchung der Empfindlichkeit von Biofilmarzneimitteln ohne Störung der Biofilmstruktur21. Darüber hinaus wird diese Methode aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Genauigkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihres hohen Reproduzierbarkeitsgrades in Candida-Pilzlebensfähigkeitsbewertungen implementiert 7,22.

Neben dem XTT-Reduktionstest wurden auch zahlreiche alternative Techniken zur Messung der Biofilmmenge identifiziert. Einige davon umfassen die Verwendung des MTT-Reduktionsassays, die Kristallviolettfärbung, die DNA-Quantifizierung, die quantitative PCR, die Proteinquantifizierung, die Messung des Trockenzellgewichts und die Zählung lebensfähiger Kolonien. Diese Verfahren unterscheiden sich stark in Bezug auf ihren Zeit- und Kostenaufwand. Taff et al. führten eine vergleichende Analyse von sieben verschiedenen Candida-Biofilm-Quantifizierungsassays durch und stellten fest, dass der XTT-Assay die reproduzierbarste, genaueste und effizienteste Methode für die quantitative Schätzung von C. albicans-Biofilmen darstellte23. Färbetechniken wie Kristallviolett haben bestimmte Einschränkungen; Der Kristallvioletttest bestimmt indirekt die Menge an Biofilm, indem er die optische Dichte der kristallviolett gefärbten Biofilmmatrix und -zellen misst. Obwohl der kristallviolette Assay ein gutes Maß für die Biofilmmasse liefert, gibt er kein Maß für die Biofilmlebensfähigkeit, da er sowohl mikrobielle Zellen als auch die extrazelluläre Matrix färbt24. Dhale et al. berichteten weiter, dass der XTT-Reduktionstest die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, effizienteste und spezifischste Methode zum Nachweis der Biofilmproduktion im Vergleich zum kristallvioletten Assay25 war. Literaturberichte haben gezeigt, dass der XTT-Assay gut mit dem CFU/mL-Parameter in der CFU-Zählmethode korreliert. Im Vergleich zum XTT-Assay ist die CFU-Methode jedoch arbeitsintensiv und langsam26. Darüber hinaus ist der Anteil abgelöster lebender Zellen möglicherweise nicht repräsentativ für die ursprüngliche Biofilmpopulation27. Obwohl der XTT-Reduktionstest die beste verfügbare Option zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit zu sein scheint, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Während die XTT-Methode für Vergleiche mit einem Pilzstamm nützlich ist, kann ihre Verwendung beim Vergleich verschiedener Pilzstämme und -arten begrenzt sein. Vergleiche zwischen Stämmen können ohne detaillierte Standardisierung schwierig sein, da verschiedene Stämme Substrate mit unterschiedlichen Fähigkeiten metabolisieren21.

Protocol

BALB/c-Mäuse wurden in der Kleintiereinrichtung des IIT Roorkee untergebracht. Alle Tiere wurden in einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und mit einem Pelletfutter und Wasser ad libitum versorgt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des IIT Roorkee genehmigt. 1. Zubereitung von C. tropicalis HINWEIS: Der Pilz Candida tropicalis gehört zu den Erregern der Risikogruppe …

Representative Results

Candida tropicalis Biofilme wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten gezüchtet und mit einem inversen Mikroskop 40x abgebildet (Abbildung 1A). Der Biofilm wurde weiter mit Kristallviolett angefärbt und 40x mit einem inversen Mikroskop beobachtet (Abbildung 1B). Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt ein repräsentatives Bild des Biofilms von C. tropicalis (Abbildung 1C). Zur Durchführung des Biofilm-Inhibitionstests w…

Discussion

Pilzinfektionen, die durch Candida-Arten verursacht werden, sind weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden. Die wachsende Bedrohung durch invasive Pilzinfektionen erfordert die frühzeitige Behandlung solcher lebensbedrohlichen Erkrankungen. Die meisten Candida-Infektionen beinhalten die Bildung von Biofilmen, die an einer Vielzahl von Medizinprodukten haften und für die Persistenz und das Wiederauftreten von Pilzinfektionen in Krankenhäusern verantwortlich sind<sup class="xref"…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Ramalingaswami-Stipendium DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) und den Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) an S.R. Die Autoren erkennen einen ICMR-JRF-Zuschuss an P.C. und DBT-JRF-Zuschuss an P.S. Die Autoren danken Dr. Ravikant Ranjan für die Vorschläge zum Manuskript und die technische Unterstützung durch Herrn Pradeep Singh Thakur während des SEM.

Materials

15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

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Cite This Article
Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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