En løselig tetrazoliumbasert reduksjonsanalyse for å evaluere effekten av antistoffer på candida tropicalis biofilmer

Summary

En 96-brønns mikrotiterplatebasert protokoll ved bruk av en 2,3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-karboksanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduksjonsanalyse er beskrevet her, for å studere antistoffers effekter på biofilmer dannet av C. tropicalis. Denne in vitro-protokollen kan brukes til å kontrollere effekten av potensielle nye antifungale forbindelser på den metabolske aktiviteten til Candida-artsceller i biofilmer.

Abstract

Candida-arter er den fjerde vanligste årsaken til systemiske nosokomiale infeksjoner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverer ofte biofilmdannelse på implanterte enheter eller katetre, som er forbundet med økt virulens og dødelighet. Biofilmer produsert av forskjellige Candida-arter utviser forbedret motstand mot ulike antifungale stoffer. Derfor er det behov for å utvikle effektive immunterapier eller tilleggsbehandlinger mot Candida biofilmer. Mens rollen som cellulær immunitet er godt etablert i anti-Candida-beskyttelse , har rollen som humoral immunitet blitt studert mindre.

Det har blitt antatt at hemming av biofilmdannelse og modning er en av hovedfunksjonene til beskyttende antistoffer, og Candida albicans bakterierørantistoffer (CAGTA) har vist seg å undertrykke in vitro vekst og biofilmdannelse av C. albicans tidligere. Dette papiret skisserer en detaljert protokoll for å evaluere rollen som antistoffer på biofilmer dannet av C. tropicalis. Metodikken for denne protokollen involverer C. tropicalis biofilmdannelse i 96-brønns mikrotiterplater, som deretter ble inkubert i nærvær eller fravær av antigenspesifikke antistoffer, etterfulgt av en 2,3-bis (2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -5-karboksanilid-2H-tetrazolium (XTT) analyse for måling av metabolsk aktivitet av soppceller i biofilmen.

Spesifisiteten ble bekreftet ved bruk av egnede serumkontroller, inkludert Sap2-spesifikt antistoffutarmet serum. Resultatene viser at antistoffer tilstede i serum av immuniserte dyr kan hemme Candida biofilmmodning in vitro. Oppsummert gir denne artikkelen viktig innsikt i potensialet for antistoffer i utviklingen av nye immunterapier og synergistiske eller tilleggsbehandlinger mot biofilm under invasiv candidiasis. Denne in vitro-protokollen kan brukes til å kontrollere effekten av potensielle nye antifungale forbindelser på den metabolske aktiviteten til Candida-artsceller i biofilmer.

Introduction

Systemisk candidiasis er den fjerde hovedårsaken til nosokomiale infeksjoner, som er forbundet med høy sykelighet og dødelighet over hele verden. Globalt påvirker systemisk candidiasis ca. 700 000 individer¹. Candida-arter, nemlig C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata og C. auris, er den vanligste årsaken til invasive Candida-infeksjoner ². Candida-arter er opportunistiske patogener som produserer biofilmer³. Biofilmer er hovedsakelig assosiert med Candida virulens, og Candida tåler oksidative og osmotiske spenningsforhold ved å indusere biofilmdannelse⁴. Biofilmer modulerer videre uttrykket av virulensfaktorer og celleveggkomponenter og danner en eksopolymer beskyttelsesmatrise, som hjelper Candida til å tilpasse seg forskjellige vertsnisjer⁴. Biofilmer bidrar til gjærtilslutning på vertsvev og medisinske instrumenter⁵. Som sådan er biofilmdannelse forbundet med en fordel for gjær, da gjærceller i biofilmene kan unngå vertsimmunresponsen⁶. Biofilmdannelse beskytter også de patogene gjærene mot virkningen av antifungale stoffer⁵. Redusert følsomhet av C. albicans biofilmer til amfotericin B har blitt demonstrert av Pierce et ^al.7,8. Videre viser biofilmer antifungal stoffresistens mot flukonazol, noe som svekker effektiv behandling av systemisk candidiasis ^9,10.

Mikrober har en iboende tendens til å feste seg til forskjellige biotiske og abiotiske overflater, noe som resulterer i biofilmdannelse. Candida albicans, som er en dimorf sopp, finnes i gjær- og hyphalformer, og biofilmdannelsen har blitt karakterisert i forskjellige in vitro og in vivo modellsystemer¹¹. Trinnene i biofilmdannelse inkluderer adhesjon av Candida-celler til substratet, filamentasjon, proliferasjon og biofilmmodning¹¹. I utgangspunktet holder gjærformen av C. albicans seg til substrater, inkludert medisinsk utstyr og humant vev, etterfulgt av filamentasjon og spredning av C. albicans i hyphal- og pseudohyphalformer, og til slutt modning av biofilmer innebygd i ekstracellulær matrise¹¹. Biofilmdannelse bidrar i stor grad til C. albicans patogenesemekanismer¹². Candida-arter danner stoffresistente biofilmer, noe som gjør utryddelsen utfordrende¹³. En liten delmengde av C. albicans biofilmproduserende populasjon har blitt beskrevet som svært motstandsdyktig mot antifungale legemidler amfotericin B og klorhexidin¹⁴. Det er verdt å merke seg at gjærceller i biofilm har høy motstand mot multimedikamentell behandling sammenlignet med gjærceller i planktonfasen og proliferasjonsfasen¹⁴. Det har blitt foreslått at gjærceller som finnes i biofilmer er svært tolerante mot antifungale stoffer, noe som bidrar til C. albicans overlevelse i biofilmer¹⁴. Disse eksisterende cellene ble rapportert å være fenotypiske varianter av C. albicans og ikke mutanter¹⁴. Videre er celler av Candida-biofilmer kjent som “persisterceller” tolerante overfor høye doser amfotericin-B-behandling og bidrar til Candida-overlevelse, og utgjør dermed en stor byrde av tilbakevendende systemiske Candida-infeksjoner hos høyrisikopersoner¹⁵.

Økningen i antifungal stoffresistens i Candida-stammer krever forskning for nye antifungale midler og immunterapier. Som det fremgår av de ovennevnte studiene, viser Candida biofilmer redusert følsomhet for antifungale stoffer. Derfor er det behov for forbedrede immunterapier for å kontrollere dannelsen av Candida biofilm. Tidligere studier har vist at CAGTA kan gi effektiv beskyttelse mot systemiske Candida-infeksjoner ved å hemme C. albicans biofilmdannelse in vitro¹⁶. En annen studie rapporterte at immunisering av mus med C. albicans rAls3-N-protein induserer høye antistofftitere som forstyrrer C. albicans biofilmdannelse in vitro¹⁷. Anti-Als3-N antistoffer utøvde også en hemmende effekt på C. albicans spredning fra biofilm¹⁷. NDV-3A-vaksine basert på C. albicans er for tiden under klinisk utprøving, og anti-NDV-3A sera ble også funnet å redusere C. auris biofilmdannelse¹⁸. En nylig studie identifiserte inhibering av biofilmdannelse av Sap2-antistoffer som en beskyttelsesmekanisme i en murinmodell av systemisk candidiasis¹⁹.

Dette papiret skisserer en detaljert in vitro-protokoll for å evaluere effekten av antigenspesifikke antistoffer tilstede i polyklonalt serum oppnådd fra forskjellige grupper av Sap2-vaksinerte mus på preformerte Candida tropicalis biofilmer. For å oppnå dette ble en metode basert på en XTT-reduksjonsanalyse optimalisert og utviklet i laboratoriet, som kan måle biofilmens levedyktighet på en rask, sensitiv og høy gjennomstrømningsmåte, i nærvær eller fravær av antistoffer.

XTT-analysen brukes til å måle cellulær metabolsk aktivitet som en indikator på cellens levedyktighet, cellulær proliferasjon og cytotoksisitet²⁰. Denne kolorimetriske analysen er basert på reduksjonen av et gult tetrazoliumsalt, natrium 3′-[1-(fenylaminokarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksy-6-nitro) benzensulfonsyrehydrat (XTT) til et oransje formazanfargestoff av metabolsk aktive celler. Siden bare levedyktige celler kan redusere XTT, er mengden redusert XTT-formazan proporsjonal med intensiteten av farge og celle levedyktighet. Formazanfargestoffet som dannes er vannløselig og kvantifiseres direkte ved hjelp av en plateleser. På grunn av sin vannløselige natur tillater XTT-analysen studier av intakte biofilmer, samt undersøkelse av biofilmmedikamentfølsomhet, uten forstyrrelse av biofilmstruktur²¹. I tillegg er denne metoden implementert i Candida fungal levedyktighetsvurderinger på grunn av brukervennlighet, hastighet, nøyaktighet, høy gjennomstrømning og høy grad av reproduserbarhet ^7,22.

I tillegg til XTT-reduksjonsanalysen er det også identifisert mange alternative teknikker for måling av biofilmmengde. Noen av disse inkluderer bruk av MTT-reduksjonsanalysen, krystallfiolettfarging, DNA-kvantifisering, kvantitativ PCR, proteinkvantifisering, tørrcellevektmåling og levedyktig kolonitelling. Disse prosedyrene varierer mye når det gjelder tids- og kostnadskrav. Taff og medarbeidere utførte en komparativ analyse av syv forskjellige Candida biofilmkvantifiseringsanalyser og fant at XTT-analysen ga den mest reproduserbare, nøyaktige og effektive metoden for kvantitativ estimering av C. albicans biofilmer²³. Fargingsteknikker som krystallfiolett har visse begrensninger; Krystallfioletttesten bestemmer indirekte mengden biofilm ved å måle den optiske tettheten til den krystallfiolettfargede biofilmmatrisen og cellene. Selv om krystallfiolettanalysen gir et godt mål på biofilmmasse, gir den ikke et mål på biofilmens levedyktighet, da den flekker både mikrobielle celler og den ekstracellulære matrisen²⁴. Dhale og medarbeidere rapporterte videre at XTT-reduksjonsanalysen var den mest følsomme, reproduserbare, nøyaktige, effektive og spesifikke metoden for å oppdage biofilmproduksjon sammenlignet med krystallfiolett analyse²⁵. Litteraturrapporter har vist at XTT-analysen korrelerer godt med CFU / ml-parameteren i CFU-tellemetoden. Imidlertid, sammenlignet med XTT-analysen, er CFU-metoden arbeidsintensiv og langsom²⁶. Videre kan det hende at fraksjonen av frittliggende levende celler ikke er representativ for den opprinnelige biofilmpopulasjonen²⁷. Selv om XTT-reduksjonsanalysen virker som det beste tilgjengelige alternativet for å kvantifisere levedyktighet, er det noen begrensninger i denne teknikken. Mens XTT-metoden er nyttig for sammenligninger som involverer en soppstamme, kan bruken være begrenset når man sammenligner forskjellige soppstammer og arter. Interstrain sammenligninger kan være vanskelig i fravær av detaljert standardisering siden forskjellige stammer metaboliserer substrater med forskjellige evner²¹.

Protocol

BALB / c mus ble plassert i Small Animal Facility på IIT Roorkee. Alle dyrene ble vedlikeholdt i en 12 t: 12 h lys: mørk syklus ved 25 ° C og ble forsynt med pelletsdiett og vann ad libitum. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) i IIT Roorkee. 1. Fremstilling av C. tropicalis MERK: Soppen Candida tropicalis tilhører risikogruppe 2 patogener og er klassifisert som en BSL2 mikroor…

Representative Results

Candida tropicalis biofilmer ble dyrket i 96-brønns mikrotiterplater og avbildet ved 40x ved hjelp av et omvendt mikroskop (figur 1A). Biofilmen ble videre farget ved hjelp av krystallfiolett og observert ved 40x ved hjelp av et omvendt mikroskop (figur 1B). Scanning elektronmikroskopi viser et representativt bilde av C. tropicalis biofilm (figur 1C). For å utføre biofilmhemmingsanalysen ble 105 celle…

Discussion

Svampinfeksjoner forårsaket av Candida-arter er forbundet med høy sykelighet og dødelighet over hele verden. Den økende trusselen om invasiv soppinfeksjon krever tidlig behandling av slike livstruende sykdommer. De fleste Candida-infeksjoner involverer dannelse av biofilmer, som holder seg til en rekke medisinske enheter og er ansvarlige for utholdenhet og tilbakefall av soppinfeksjoner i sykehusinnstillinger³¹. Biofilmer består av gjær- eller hyphalceller, og de utviser be…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493