Summary

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Abstract

Candida-soorten zijn de vierde meest voorkomende oorzaak van systemische nosocomiale infecties. Systemische of invasieve candidiasis omvat vaak biofilmvorming op geïmplanteerde apparaten of katheters, wat geassocieerd is met verhoogde virulentie en mortaliteit. Biofilms geproduceerd door verschillende Candida-soorten vertonen een verhoogde weerstand tegen verschillende antischimmelmiddelen. Daarom is het nodig om effectieve immunotherapieën of aanvullende behandelingen tegen Candida-biofilms te ontwikkelen. Hoewel de rol van cellulaire immuniteit goed is ingeburgerd bij anti-Candida-bescherming, is de rol van humorale immuniteit minder bestudeerd.

Er is verondersteld dat remming van biofilmvorming en rijping een van de belangrijkste functies van beschermende antilichamen is, en Candida albicans kiembuisantistoffen (CAGTA) hebben aangetoond dat ze in vitro groei en biofilmvorming van C. albicans eerder onderdrukken. Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de rol van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis. De methodologie voor dit protocol omvat C. tropicalis biofilmvorming in 96-well microtiter platen, die vervolgens werden geïncubeerd in de aan- of afwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen, gevolgd door een 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) test voor het meten van de metabole activiteit van schimmelcellen in de biofilm.

De specificiteit werd bevestigd door het gebruik van geschikte serumcontroles, waaronder Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum. De resultaten tonen aan dat antilichamen in het serum van geïmmuniseerde dieren de rijping van candida-biofilm in vitro kunnen remmen. Samenvattend biedt dit artikel belangrijke inzichten met betrekking tot het potentieel van antilichamen bij het ontwikkelen van nieuwe immunotherapieën en synergetische of aanvullende behandelingen tegen biofilms tijdens invasieve candidiasis. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Introduction

Systemische candidiasis is de vierde belangrijke oorzaak van nosocomiale infecties, die wereldwijd worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers. Wereldwijd treft systemische candidiasis ongeveer 700.000 personen1. Candida-soorten, namelijk C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata en C. auris, zijn de meest voorkomende oorzaak van invasieve Candida-infecties 2. Candida-soorten zijn opportunistische pathogenen die biofilms produceren3. Biofilms worden voornamelijk geassocieerd met Candida virulentie, en Candida kan bestand zijn tegen oxidatieve en osmotische stressomstandigheden door biofilmvorming te induceren4. Biofilms moduleren verder de expressie van virulentiefactoren en celwandcomponenten en vormen een exopolymere beschermende matrix, waardoor Candida zich kan aanpassen aan verschillende gastheerniches4. Biofilms dragen bij tot de hechting van gist op gastheerweefsels en medische instrumenten5. Als zodanig is biofilmvorming geassocieerd met een voordeel voor gisten, omdat gistcellen in de biofilms de immuunrespons van de gastheer kunnen ontwijken6. Biofilmvorming beschermt ook de pathogene gisten tegen de werking van antischimmelmiddelen5. Verminderde gevoeligheid van C. albicans biofilms voor amfotericine B is aangetoond door Pierce et al.7,8. Bovendien tonen biofilms antischimmelresistentie tegen fluconazol, wat een effectief beheer van systemische candidiasis schaadt 9,10.

Microben hebben een intrinsieke neiging om zich te hechten aan verschillende biotische en abiotische oppervlakken, wat resulteert in biofilmvorming. Candida albicans, een dimorfe schimmel, komt voor in gist- en hyphale vormen en de biofilmvorming ervan is gekarakteriseerd in verschillende in vitro en in vivo modelsystemen11. De stappen van biofilmvorming omvatten de hechting van Candida-cellen aan het substraat, filamentatie, proliferatie en biofilmrijping11. Aanvankelijk hecht de gistvorm van C. albicans zich aan substraten, waaronder medische hulpmiddelen en menselijk weefsel, gevolgd door filamentatie en proliferatie van C. albicans in hyphale en pseudohyphale vormen, en ten slotte rijping van biofilms ingebed in extracellulaire matrix11. Biofilmvorming draagt grotendeels bij aan C. albicans pathogenese mechanismen12. Candida-soorten vormen resistente biofilms, waardoor hun uitroeiing uitdagendis 13. Een kleine subgroep van de C. albicans biofilmproducerende populatie is beschreven als zeer resistent tegen de antischimmelmiddelen amfotericine B en chloorhexidine14. Van belang is dat gistcellen in biofilms een hoge weerstand vertonen tegen multidrugtherapie in vergelijking met gistcellen in de planktonfase en proliferatiefase14. Er is gesuggereerd dat gistcellen in biofilms zeer tolerant zijn voor antischimmelmiddelen, wat bijdraagt aan de overleving van C. albicans in biofilms14. Deze bestaande cellen waren fenotypische varianten van C. albicans en geen mutanten14. Bovendien zijn cellen van Candida-biofilms die bekend staan als “persistercellen” tolerant voor hoge doses amfotericine-B-behandeling en dragen ze bij aan de overleving van Candida, waardoor ze een grote last vormen van terugkerende systemische Candida-infecties bij personen met een hoog risico15.

De toename van antischimmelresistentie bij Candida-stammen vereist onderzoek naar nieuwe antischimmelmiddelen en immunotherapieën. Zoals blijkt uit de bovengenoemde studies, tonen Candida-biofilms een verminderde gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Daarom is er behoefte aan verbeterde immunotherapieën om candida biofilmvorming onder controle te houden. Eerdere studies hebben aangetoond dat CAGTA effectieve bescherming kan bieden tegen systemische Candida-infecties door de vorming van C. albicans biofilm in vitrote remmen 16. Een andere studie meldde dat immunisatie van muizen met C. albicans rAls3-N-eiwit hoge antilichaamtiters induceert die interfereren met de vorming van C. albicans biofilm in vitro17. Anti-Als3-N antilichamen oefenden ook een remmend effect uit op C. albicans dispersie uit biofilms17. NDV-3A-vaccin op basis van C. albicans wordt momenteel klinisch getest en anti-NDV-3A-sera bleken ook de vorming van C. auris-biofilm te verminderen18. Een recente studie identificeerde remming van biofilmvorming door Sap2-antilichamen als een beschermingsmechanisme in een muizenmodel van systemische candidiasis19.

Dit artikel schetst een gedetailleerd in vitro protocol voor het evalueren van het effect van antigeenspecifieke antilichamen aanwezig in polyklonaal serum verkregen uit verschillende groepen Sap2-gevaccineerde muizen op voorgevormde Candida tropicalis-biofilms . Om dit te bereiken, werd een methode op basis van een XTT-reductietest geoptimaliseerd en ontwikkeld in het laboratorium, die de levensvatbaarheid van biofilm op een snelle, gevoelige en high-throughput manier kan meten, in de aan- of afwezigheid van antilichamen.

De XTT-test wordt gebruikt om cellulaire metabole activiteit te meten als een indicator van de levensvatbaarheid van cellen, cellulaire proliferatie en cytotoxiciteit20. Deze colorimetrische test is gebaseerd op de reductie van een geel tetrazoliumzout, natrium 3′-[1-(fenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzeensulfonzuurhydraat (XTT) tot een oranje formazankleurstof door metabolisch actieve cellen. Omdat alleen levensvatbare cellen XTT kunnen verminderen, is de hoeveelheid verminderde XTT-formazan evenredig met de intensiteit van kleur en levensvatbaarheid van cellen. De gevormde formazankleurstof is wateroplosbaar en wordt direct gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Vanwege de in water oplosbare aard maakt de XTT-test de studie van intacte biofilms mogelijk, evenals het onderzoek van de gevoeligheid van biofilmgeneesmiddelen, zonder verstoring van de biofilmstructuur21. Bovendien wordt deze methode geïmplementeerd in Candida schimmel levensvatbaarheid beoordelingen vanwege het gebruiksgemak, snelheid, nauwkeurigheid, hoge doorvoer en hoge mate van reproduceerbaarheid 7,22.

Naast de XTT-reductietest zijn er ook tal van alternatieve technieken geïdentificeerd voor het meten van de hoeveelheid biofilm. Sommige hiervan omvatten het gebruik van de MTT-reductietest, kristalvioletkleuring, DNA-kwantificering, kwantitatieve PCR, eiwitkwantificering, droge celgewichtmeting en levensvatbare kolonietelling. Deze procedures variëren sterk in termen van hun tijd- en kostenvereisten. Taff et al. voerden een vergelijkende analyse uit van zeven verschillende Candida biofilm quantitatie assays en vonden dat de XTT assay de meest reproduceerbare, nauwkeurige en efficiënte methode leverde voor de kwantitatieve schatting van C. albicans biofilms23. Kleuringstechnieken zoals kristalviolet hebben bepaalde beperkingen; de kristalviolettest bepaalt indirect de hoeveelheid biofilm door de optische dichtheid van de met kristalvioleten gekleurde biofilmmatrix en cellen te meten. Hoewel de kristalviolettest een goede maat voor de biofilmmassa biedt, geeft het geen maat voor de levensvatbaarheid van de biofilm, omdat het zowel microbiële cellen als de extracellulaire matrixkleurt 24. Dhale et al. rapporteerden verder dat de XTT-reductietest de meest gevoelige, reproduceerbare, nauwkeurige, efficiënte en specifieke methode was om biofilmproductie te detecteren in vergelijking met kristalviolettest25. Literatuurrapporten hebben aangetoond dat de XTT-test goed correleert met de CFU / ml-parameter in de CFU-telmethode. In vergelijking met de XTT-test is de CFU-methode echter arbeidsintensief en traag26. Bovendien is de fractie van losse levende cellen mogelijk niet representatief voor de initiële biofilmpopulatie27. Hoewel de XTT-reductietest de best beschikbare optie lijkt om de levensvatbaarheid te kwantificeren, zijn er een paar beperkingen van deze techniek. Hoewel de XTT-methode nuttig is voor vergelijkingen met één schimmelstam, kan het gebruik ervan beperkt zijn bij het vergelijken van verschillende schimmelstammen en soorten. Interstrain-vergelijkingen kunnen moeilijk zijn bij gebrek aan gedetailleerde standaardisatie, omdat verschillende stammen substraten metaboliseren met verschillende mogelijkheden21.

Protocol

BALB/c muizen werden ondergebracht in de Small Animal Facility bij IIT Roorkee. Alle dieren werden gehouden in een 12 h:12 h licht:donker cyclus bij 25 °C en werden voorzien van een pelletdieet en water ad libitum. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) van IIT Roorkee. 1. Bereiding van C. tropicalis OPMERKING: De schimmel Candida tropicalis behoort tot de pathogenen van ri…

Representative Results

Candida tropicalis biofilms werden gekweekt in 96-well microtiter platen en in beeld gebracht op 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1A). De biofilm werd verder gekleurd met kristalviolet en waargenomen bij 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1B). Scanning elektronenmicroscopie toont een representatief beeld van C. tropicalis biofilm (figuur 1C). Voor het uitvoeren van de biofilm r…

Discussion

Schimmelinfecties veroorzaakt door Candida-soorten worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers wereldwijd. De groeiende dreiging van invasieve schimmelinfectie vereist het vroege beheer van dergelijke levensbedreigende ziekten. De meeste Candida-infecties omvatten de vorming van biofilms, die zich hechten aan een verscheidenheid aan medische hulpmiddelen en verantwoordelijk zijn voor de persistentie en herhaling van schimmelinfecties in ziekenhuisomgevingen31. Bi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Ramalingaswami-subsidie DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) en Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) aan S.R. De auteurs erkennen een ICMR-JRF-subsidie aan P.C. en DBT-JRF-subsidie aan P.S. De auteurs bedanken Dr. Ravikant Ranjan voor suggesties over het manuscript en technische assistentie door de heer Pradeep Singh Thakur tijdens SEM.

Materials

15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Play Video

Cite This Article
Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

View Video