פסי אבי העורקים O-Ring לעומת כיווץ אבי העורקים הרוחבי המסורתי למידול היפרטרופיה לבבית הנגרמת על ידי עומס יתר בלחץ
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה חדשה של פסים באבי העורקים בעכברים כדי לגרום לעומס יתר על הלחץ היפרטרופיה לבבית. עבור להקות, טבעת גומי עם קוטר פנימי קבוע משמש. טכניקה חדשה זו מבטיחה פחות שונות ויותר נתונים הניתנים לשחזור עבור ניסויים עתידיים.
Abstract
פסים באבי העורקים בעכברים הם אחד המודלים הניסיוניים הנפוצים ביותר להיפרטרופיה לבבית הנגרמת על ידי עומס יתר בלחץ לב והשראת אי ספיקת לב. הטכניקה ששימשה בעבר מבוססת על תפר מושחל סביב קשת אבי העורקים הקשורה מעל מחט קהה של 27 G כדי ליצור היצרות. שיטה זו תלויה במנתח הידוק ידני של החוט, ובכך מוביל לשונות גבוהה בגודל הקוטר. שיטה חדשה ומעודנת שתוארה על ידי Melleby et al. מבטיחה פחות שונות ויותר שכפול לאחר הניתוח. הטכניקה החדשה, o-ring- aortic banding (ORAB), משתמשת בטבעת גומי מונעת החלקה במקום בתפר עם חוט, וכתוצאה מכך מופחתת השונות בעומס הלחץ ובפנוטיפים הניתנים לשחזור של היפרטרופיה לבבית. במהלך הניתוח, o-ring ממוקם בין העורקים brachiocephalic ו שמאל הצוואר. התכווצות מוצלחת מאושרת על ידי אקוקרדיוגרפיה. לאחר יום אחד, מיקום נכון של הטבעת גורם למהירות זרימה מוגברת באבי העורקים הרוחבי על פני היצרות הנגרמת על ידי o-ring. לאחר שבועיים, תפקוד לב לקוי מוכח על ידי ירידה בחלק הפליטה ועובי דופן מוגבר. חשוב לציין כי מלבד שונות פחותה בגודל הקוטר, ORAB קשור לשיעורי תמותה תוך-ניתוחיים ופוסט-ניתוחיים נמוכים יותר בהשוואה להתכווצות אבי העורקים הרוחבי (TAC). לפיכך, ORAB מייצג שיטה עדיפה על ניתוח TAC הנפוץ, וכתוצאה מכך תוצאות ניתנות לשחזור יותר והפחתה אפשרית במספר בעלי החיים הדרושים.
Introduction
בעוד שניתן לצפות בהיפרטרופיה לבבית פיזיולוגית במהלך ההתפתחות, הפעילות הגופנית וההריון, היפרטרופיה לבבית פתולוגית מגיבה למצבי עקה המודינמיים כמו יתר לחץ דם עורקי, מחלת לב ערכית או מוטציות גנטיות. בתחילה, הלב עובר שיפוץ המאופיין בגודל קרדיומיוציטים מוגבר ועיבוי של קירות החדר כדי לשמור על תפקוד הלב 1,2. מאידך גיסא, שיפוץ לב פתולוגי קשור לסיכון מוגבר להפרעות קצב, מוות פתאומי ותמותה גבוהה. לבסוף, עם הזמן, זה גורם להתרחבות חדרית, ירידה חזקה בתפקוד ההתכווצות, ובסופו של דבר התקדמות לאי ספיקת לב (HF), אשר קשורה תחלואה גבוהה, תמותה, ועלויות חברתיות3. לכן, יש צורך דחוף להבין את הרקע המולקולרי על מנת לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות4.
פסים באבי העורקים הם מודל המחקה היפרטרופיה של עומס יתר על החדר השמאלי (LV) ואי ספיקת לב בעכברים5. בשיטה זו, ניתן לבחון את הפתומנגינות של שיפוץ לב הנגרם על ידי עומס יתר בלחץ in vivo. הליך הפסים הראשון של אבי העורקים בעכברים דווח על ידי Rockman et al.6. עומס יתר בלחץ נגרם על ידי קשירה מבוססת תפר חוט סביב אבי העורקים (בין עורק הצוואר הברכיוצפלי לעורק הצוואר המשותף השמאלי). כדי ליצור היצרות בקוטר 0.4 מ”מ, תפר ממוקם סביב מחט 27 גרם ואת אבי העורקים. לאחר קשירה, המחט מוסרת 6,7.
למרות שקוטר המחט קבוע, הידוק החוט תלוי מאוד במנתח, ולכן משפיע על הפנוטיפ המושרה של היפרטרופיה לבבית. בנוסף, בשיטה מבוססת חוט/תפר, קיימת דרגת היצרות משתנה לאחר הניתוח, הקשורה לשונות גבוהה בתמותה 8,9. יתר על כן, אימון בשיטה זו הוא מאתגר, במיוחד לגבי מציאת הרמה הנכונה ועקביות בהידוק החוט. לבסוף, בתחילת האימון מתרחשת תמותה תוך-ניתוחית גבוהה ופוסט-ניתוחית עקב הפרעה באבי העורקים או פגיעה ברקמות אחרות, כמו גם שונות גבוהה במידת ההיצרות אצל בעלי החיים ששרדו.
לאחרונה, הליך אופטימלי של פסים אבי העורקים תואר על ידי Melleby et al.10. הם הציגו את שיטת ORAB (פסים אאורטליים של o-ring) עם פחות שונות בהיצרות ורמות שכפולות מאוד של עומס לחץ על ידי שימוש בטבעת o גומי מונעת החלקה עם קוטר פנימי קבוע של 0.71 מ”מ, 0.66 מ”מ ו-0.61 מ”מ. בקיצור, טבעת ה- o נחתכת, מונחת סביב הקשת העולה, ונסגרת שוב על ידי חוטים. מדענים אחרים שהשתמשו בטבעות O אלה דיווחו על שונות פחותה בהיפרטרופיה לבבית9. הם גם צפו בתמותה תוך-ניתוחית ואחריה, כמו גם בשחזור טוב יותר ובשונות פחותה בפנוטיפ ההיפרטרופיהמושרה 9,11. המאמר הנוכחי מתאר את ההליך של אסטרטגיה ייחודית זו בפרוטוקול שלב אחר שלב. המומחיות המשותפת בדו”ח זה תסייע למדענים אחרים לשפר את הטכניקות שלהם בתחום זה.
כדי לגרום להיפרטרופיה לבבית וכתוצאה מכך לאי ספיקת לב לאחר 6 שבועות, עכברים זכרים C57BL/6N בני 12 שבועות מומלצים לניתוח. השוואה של שבועיים לאחר פסים של אבי העורקים בין תת-הזנים של העכברים C57BL/6N ו-C57BL/6J הראתה תפקוד לב חמור ותמותה מוגברת נלווית בעכברים C57BL/6N. לכן, אלה מתאימים יותר עבור מודלים של אי ספיקת לב12. עכברים זכרים ונקבות בני 12 שבועות הם בעלי גודל אופטימלי לחשיפה של אבי העורקים ומיקום ה- o-ring עם מכשירים מיוחדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פסים אאורטליים מבוססי חוט/תפר משמשים כבר שנים רבות כדי לגרום להיפרטרופיה לבבית של עומס יתר בעכברים. זוהי שיטה מבוססת לחקור את הפתומנגמניזמים של שיפוץ לב והתקדמות המחלה in vivo. המגבלות הן השונות הגבוהה יחסית במידת ההיצרות וכתוצאה מכך השיפוץ. טכניקת ORAB שהוצגה לאחרונה ותוארה לראשונה על י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ה-Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) ל-L.L., N.F., ו-O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
