O-링 대동맥 밴딩 대 압력 과부하로 인한 심장 비대 모델링을 위한 기존의 횡대동맥 수축
Summary
본 프로토콜은 심장 비대에 압력 과부하를 유도하기 위해 마우스에서 대동맥 밴딩의 새로운 기술을 기술한다. 밴딩에는 내경이 고정 된 고무 링이 사용됩니다. 이 새로운 기술은 향후 실험을 위해 변동을 줄이고 재현 가능한 데이터를 약속합니다.
Abstract
마우스의 대동맥 밴딩은 심장 압력 과부하로 인한 심장 비대 및 심부전 유도에 가장 일반적으로 사용되는 실험 모델 중 하나입니다. 이전에 사용 된 기술은 협착을 만들기 위해 무딘 27G 바늘 위에 묶인 대동맥 궁 주위의 나사산 봉합사를 기반으로합니다. 이 방법은 외과 의사가 수동으로 실을 조이는 것에 달려 있으므로 직경 크기의 차이가 커집니다. Melleby et al.이 설명한 새롭게 정제 된 방법은 수술 후 변동성이 적고 재현성이 높아집니다. 새로운 기술인 O-링 대동맥 밴딩(ORAB)은 실이 있는 봉합사 대신 미끄럼 방지 고무 링을 사용하여 압력 과부하의 변화를 줄이고 심장 비대의 재현 가능한 표현형을 제공합니다. 수술 중 O- 링은 상완 동맥과 왼쪽 경동맥 사이에 위치합니다. 성공적인 수축은 심 초음파로 확인됩니다. 1일 후, 링을 올바르게 배치하면 O-링으로 인한 협착에 대한 횡대동맥의 유속이 증가합니다. 2 주 후, 손상된 심장 기능은 박출률 감소 및 벽 두께 증가로 입증됩니다. 중요하게도, 직경 크기의 변동이 적을 뿐만 아니라, ORAB는 횡대동맥 수축(TAC)에 비해 수술 중 및 수술 후 사망률이 낮다는 것과 관련이 있습니다. 따라서 ORAB는 일반적으로 사용되는 TAC 수술보다 우수한 방법을 나타내며 결과적으로 재현 가능한 결과와 필요한 동물 수를 줄일 수 있습니다.
Introduction
생리적 심장 비대는 발달, 운동 및 임신 중에 관찰 될 수 있지만 병리학 적 심장 비대는 동맥 고혈압, 판막 심장 질환 또는 유전자 돌연변이와 같은 혈역학 적 스트레스 상태에 반응합니다. 처음에 심장은 심장 기능을 유지하기 위해 심근 세포 크기가 증가하고 심실 벽이 두꺼워지는 것을 특징으로하는 리모델링을 거칩니다 1,2. 반면에 병리학 적 심장 리모델링은 부정맥, 갑작스런 사망 및 높은 사망률의 위험 증가와 관련이 있습니다. 마지막으로, 시간이 지남에 따라 심실 확장, 수축 기능의 강력한 감소, 그리고 결국 높은 이환율, 사망률 및사회적 비용과 관련된 심부전(HF)으로의 진행을 초래합니다3. 따라서 새로운 치료 전략을 개발하기 위해서는 분자 배경을 이해하는 것이 시급합니다4.
대동맥 밴딩은 마우스5에서 압력 과부하 유발 좌심실 (LV) 비대 및 심부전을 모방하는 모델입니다. 이 방법을 사용하면 생체 내에서 압력 과부하 유발 심장 리모델링의 병리 메커니즘을 검사 할 수 있습니다. 마우스의 첫 번째 대동맥 밴딩 절차는 Rockman et al.6에 의해보고되었습니다. 압력 과부하는 대동맥 주위의 실 봉합 기반 결찰에 의해 유도됩니다 (상완 두개와 왼쪽 총 경동맥 사이). 0.4mm 직경의 협착을 만들기 위해 봉합사를 27G 바늘과 대동맥 주위에 놓습니다. 결찰 후 바늘을 제거합니다 6,7.
바늘 직경이 고정되어 있더라도 실의 조임은 외과 의사에 크게 의존하므로 심장 비대의 유도 표현형에 영향을 미칩니다. 또한 실/봉합사 기반 방법에서는 수술 후 협착 직경의 정도가 다양하여사망률의 높은 변동과 관련이 있습니다8,9. 또한이 방법을 훈련하는 것은 특히 나사를 조이는 데 올바른 수준과 일관성을 찾는 것과 관련하여 어렵습니다. 마지막으로, 훈련 시작시 대동맥의 파괴 또는 기타 조직 손상으로 인한 수술 중 및 수술 후 사망률이 높고 생존 동물의 협착 정도가 크게 변합니다.
최근에, 대동맥 밴딩의 최적화 된 절차가 Melleby et al.10에 의해 기술되었다. 그들은 내경이 0.71mm, 0.66mm 및 0.61mm인 고정 미끄럼 방지 고무 O-링을 사용하여 협착의 변동이 적고 압력 과부하의 재현성이 높은 ORAB(O-링 대동맥 밴딩) 방법을 제시했습니다. 요컨대, O- 링을 잘라내어 오름차순 아치 주위에 놓고 나사산으로 다시 닫습니다. 이러한 O-링을 사용하는 다른 과학자들은 유도된 심장 비대에서 더 적은 변동성을 보고했습니다9. 그들은 또한 수술 중 및 수술 후 사망률뿐만 아니라 유도 된 비대 표현형 9,11의 재현성이 향상되고 변동이 적다는 것을 관찰했습니다. 이 기사에서는 단계별 프로토콜에서이 고유 한 전략의 절차를 설명합니다. 이 보고서에서 공유 된 전문 지식은 다른 과학자들이이 분야에서 기술을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.
6주 후 심부전을 유발하는 심장 비대를 유도하려면 12주 된 C57BL/6N 수컷 마우스를 수술에 권장합니다. 마우스 하위 균주 C57BL/6N과 C57BL/6J 사이의 대동맥 밴딩 2주 후 비교는 C57BL/6N 마우스에서 심각한 심장 기능 장애 및 관련 사망률 증가를 보여주었습니다. 따라서 이들은 심부전 모델에 더 적합합니다12. 12 주 된 수컷과 암컷 마우스는 대동맥의 노출과 특수기구로 O- 링을 배치하기에 최적의 크기를 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스레드 / 봉합사 기반 대동맥 밴딩은 마우스에서 압력 과부하 심장 비대를 유도하기 위해 수년 동안 사용되어 왔습니다. 생체 내에서 심장 리모델링 및 질병 진행의 병리 메커니즘을 조사하는 확립 된 방법입니다. 한계는 협착 정도의 상대적으로 높은 차이와 결과적으로 리모델링입니다. Melleby et al.10 에 의해 처음 기술된 최근 도입된 ORAB 기술은 고무 O-링을 사용하여 기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF)의 지원을 받아 L.L., N.F. 및 O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
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