O-ring aortabandning kontra traditionell tvärgående aortaförträngning för modellering av överbelastningsinducerad hjärthypertrofi
Summary
Detta protokoll beskriver en ny teknik för aortabandning hos möss för att inducera trycköverbelastning av hjärthypertrofi. För bandning används en gummiring med en fast innerdiameter. Denna nya teknik lovar mindre varians och mer reproducerbara data för framtida experiment.
Abstract
Aortabandning hos möss är en av de vanligaste experimentella modellerna för överbelastningsinducerad hjärthypertrofi och induktion av hjärtsvikt. Den tidigare använda tekniken är baserad på en gängad sutur runt aortabågen bunden över en avtrubbad 27 G-nål för att skapa stenos. Denna metod beror på att kirurgen manuellt drar åt tråden och leder därmed till hög varians i diameterstorleken. En nyligen förfinad metod som beskrivs av Melleby et al. lovar mindre varians och mer reproducerbarhet efter operationen. Den nya tekniken, o-ring- aortabandning (ORAB), använder en halkfri gummiring istället för en sutur med tråd, vilket resulterar i minskad variation i trycköverbelastning och reproducerbara fenotyper av hjärthypertrofi. Under operationen placeras o-ringen mellan brachiocephalic och vänster carotid artärer. Framgångsrik förträngning bekräftas av ekokardiografi. Efter 1 dag resulterar korrekt placering av ringen i en ökad flödeshastighet i den tvärgående aortan över den o-ringinducerade stenosen. Efter 2 veckor bevisas nedsatt hjärtfunktion genom minskad utstötningsfraktion och ökad väggtjocklek. Viktigt är att förutom mindre varians i diameterstorleken, är ORAB associerat med lägre intra- och postoperativ dödlighet jämfört med tvärgående aortaförträngning (TAC). Således representerar ORAB en överlägsen metod än den vanliga TAC-operationen, vilket resulterar i mer reproducerbara resultat och en möjlig minskning av antalet djur som behövs.
Introduction
Medan fysiologisk hjärthypertrofi kan observeras under utveckling, träning och graviditet, svarar patologisk hjärthypertrofi på hemodynamiska stressförhållanden som arteriell hypertoni, klaffsjukdom eller genmutationer. Initialt genomgår hjärtat en ombyggnad som kännetecknas av ökad kardiomyocytstorlek och förtjockning av ventrikulära väggar för att upprätthålla hjärtfunktionen 1,2. Å andra sidan är patologisk hjärtombyggnad förknippad med en ökad risk för arytmi, plötslig död och hög dödlighet. Slutligen, med tiden, resulterar det i ventrikulär utvidgning, en stark minskning av kontraktil funktion och eventuell progression till hjärtsvikt (HF), vilket är förknippat med hög sjuklighet, dödlighet och samhällskostnader3. Därför finns det ett brådskande behov av att förstå den molekylära bakgrunden för att utveckla nya terapeutiska strategier4.
Aortabandning är en modell som efterliknar trycköverbelastningsinducerad vänsterkammarhypertrofi (LV) och hjärtsvikt hos möss5. Med denna metod är det möjligt att undersöka patomekanismerna för trycköverbelastningsinducerad hjärtombyggnad in vivo. Det första aortabandningsförfarandet hos möss rapporterades av Rockman et al.6. Trycköverbelastning induceras av en trådsuturbaserad ligering runt aortan (mellan brachiocephalic och vänster vanlig halspulsåder). För att skapa en stenos med en diameter på 0,4 mm placeras en sutur runt en 27 G nål och aortan. Efter ligering avlägsnas nålen 6,7.
Även om nåldiametern är fixerad är trådens täthet mycket beroende av kirurgen och påverkar därför den inducerade fenotypen av hjärthypertrofi. I den tråd/suturbaserade metoden finns dessutom en varierande grad av stenosdiameter efter operation, associerad med en hög varians i mortalitet 8,9. Dessutom är det utmanande att träna denna metod, särskilt när det gäller att hitta rätt nivå och konsistens vid åtdragning av tråden. Slutligen, i början av träningen, uppstår hög intra- och postoperativ dödlighet på grund av störning av aortan eller annan vävnadsskada, liksom hög variation i omfattningen av stenos hos de överlevande djuren.
Nyligen beskrevs ett optimerat förfarande för aortabandning av Melleby et al.10. De presenterade ORAB-metoden (o-ring aortabanding) med mindre varians i stenos och mycket reproducerbara nivåer av trycköverbelastning genom att använda en halkfri gummi-o-ring med en fast innerdiameter på 0,71 mm, 0,66 mm och 0,61 mm. Kort sagt, o-ringen skärs upp, placeras runt den stigande bågen och stängs igen av trådar. Andra forskare som använde dessa o-ringar rapporterade mindre variation i den inducerade hjärthypertrofi9. De observerade också intra- och postoperativ dödlighet, liksom bättre reproducerbarhet och mindre varians i den inducerade hypertrofiska fenotypen 9,11. Den här artikeln beskriver proceduren för denna unika strategi i ett steg-för-steg-protokoll. Den expertis som delas i denna rapport kommer att hjälpa andra forskare att förbättra sina tekniker på detta område.
För att inducera hjärthypertrofi som resulterar i hjärtsvikt efter 6 veckor rekommenderas 12 veckor gamla C57BL/6N hanmöss för operation. En jämförelse 2 veckor efter aortabandning mellan mussubstammarna C57BL/6N och C57BL/6J visade allvarlig hjärtdysfunktion och tillhörande ökad dödlighet hos C57BL/6N-möss. Därför är dessa bättre lämpade för modeller av hjärtsvikt12. Tolvveckors gamla manliga och kvinnliga möss har en optimal storlek för exponering av aortan och placering av o-ringen med specialinstrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tråd/suturbaserad aortabandning har använts i många år för att inducera trycköverbelastning av hjärthypertrofi hos möss. Det är en etablerad metod för att undersöka patomekanismerna för hjärtombyggnad och sjukdomsprogression in vivo. Begränsningarna är den relativt höga variansen i graden av stenos och följaktligen ombyggnaden. Den nyligen introducerade ORAB-tekniken som först beskrevs av Melleby et al.10 optimerar den konventionella metoden genom att använda en o-ring…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) till L.L., N.F. och O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
