Isolering av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus
Summary
Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går vanligvis tapt ved sentrifugering av tetthetsgradient. Her presenterer vi en optimalisert celleisolasjonsprotokoll som beholder steatotiske hepatocytter, noe som gir representative populasjoner av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus.
Abstract
Delvis hepatektomi har vært mye brukt til å undersøke leverregenerering hos mus, men isolering av høye utbytter av levedyktige hepatocytter for nedstrøms enkeltcelleapplikasjoner er utfordrende. En markert akkumulering av lipider i regenererende hepatocytter observeres i løpet av de første 2 dagene av normal leverregenerering hos mus. Denne såkalte transiente regenereringsassosierte steatosen (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvis den store proliferative fasen. Density-gradient rensing er ryggraden i de fleste eksisterende protokoller for isolering av primære hepatocytter. Siden gradientrensing er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, skiller den ikke-steatotisk fra steatotiske hepatocyttpopulasjoner. Derfor går fete hepatocytter ofte tapt, noe som gir ikke-representative hepatocytfraksjoner.
Den presenterte protokollen beskriver en enkel og pålitelig metode for in vivo-isolering av regenererende hepatocytter uavhengig av lipidinnholdet. Hepatocytter fra mannlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte dårligere vena cava inn i resten, ved hjelp av en retrograd perfusjonsteknikk med utstrømning gjennom portalvenen. Hepatocytter dissocieres av kollagenase for frigjøring fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig sentrifugering kan hepatocytter brukes til eventuelle nedstrømsanalyser. Avslutningsvis beskriver dette papiret en enkel og reproduserbar teknikk for isolering av en representativ populasjon av regenererende hepatocytter etter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjelpe studiet av fettleversykdom.
Introduction
Leveren kan regenerere seg selv selv etter stort vevstap. Denne unike regenerative kapasiteten er eksplisitt illustrert av den eksperimentelle modellen for delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter av Higgins og Anderson i 19311. I denne modellen fjernes 70% av leveren kirurgisk fra dyr ved å klippe av større leverlapper. De resterende vokser deretter gjennom kompenserende hypertrofi for å gjenopprette den opprinnelige levermassen innen ca. 1 uke etter operasjonen, om enn uten restaurering av den opprinnelige leverarkitekturen 2,3. Ytterligere hepatektomier med varierende mengder vevsfjerning har blitt utviklet, for eksempel 86% utvidet hepatektomi hvor leverresten er for liten til å gjenopprette, noe som til slutt fører til posthepatektomi leversvikt (PHLF) og etterfølgende død hos 30% -50% av dyrene 4,5,6. Disse modellene muliggjør studier av normal og mislykket leverregenerering, avhengig av mengden resektert vev (figur 1).
Selv om musemodeller av hepatektomier har blitt brukt med suksess i mange år, har bare nylig mer avanserte analysemetoder tillatt en dypere innsikt på enkeltcellenivå. For de fleste av disse metodene er imidlertid tilstedeværelsen av individuelle hepatocytter en grunnleggende forutsetning. De fleste protokoller for isolering av primære hepatocytter er basert på en to-trinns kollagenaseperfusjonsteknikk og påfølgende tetthetsgradientrensing for å skille levedyktige hepatocytter fra rusk og ikke-parenkymal, samt døde celler 7,8,9. Denne metoden ble først beskrevet av Berry og Friend i 196910 og tilpasset av Seglen og kolleger i 197211,12. Imidlertid, da gradientsentrifugering er avhengig av tettheten og størrelsen på cellene, går lipidbelastede hepatocytter ofte tapt under standard rensing. Selv om et slikt tap kan være ubetydelig for mange forskningsspørsmål, er det et avgjørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løpet av de første 2 dagene akkumulerer hepatocytter i den regenererende museleveren lipider, og vokser dermed i størrelse og dypper i tetthet. Denne forbigående regenereringsassosierte steatosen (TRAS) tjener til å gi regenerativt drivstoff og er midlertidig, men overlapper delvis den viktigste proliferative fasen og er ujevnt fordelt i leverlobulene – de funksjonelle enhetene i leveren13,14. Etter utvidet 86% -hepatektomi oppstår imidlertid TRAS også, men vedvarer, fordi regenerering er stoppet og lipider ikke blir oksidert14. Derfor vil gradientrensing av hepatocytter etter 70%- eller 86%-hepatektomier gi ikke-representative fraksjoner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tapt på grunn av deres lave tetthet15.
I denne modifiserte isolasjonsprotokollen isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer etter hepatektomi ved en klassisk to-trinns kollagenaseperfusjonstilnærming. Vanligvis gjøres kanylering og perfusjon av resten for celleisolasjon via portalvenen. Portovaskulær resistens i små rester etter større reseksjon er imidlertid høy16, og perfusjonen er derfor ømfintlig. Fordi vena cava forblir upåvirket av hepatektomier, kan perfusjon lett utføres i retrograd retning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de oppvarmede løsningene via den kateteriserte vena cava inferior inn i leverresten, ved bruk av retrograd perfusjon med utstrømning gjennom portvenen (tilleggsfigur S1). Hepatocytter dissocieres av kollagenaser og frigjøres fra Glissons kapsel. Etter vask og forsiktig behandling av levedyktige hepatocytter ved trinnvis isolasjon ved hjelp av en lavhastighets sentrifugeringsmetode, kan hepatocytter brukes til alle nedstrømsanalyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den publiserte protokollen gir en pålitelig og enkel metode for å isolere et høyt utbytte av normale og steatotiske murine hepatocytter for enkeltcelle nedstrømsanalyser eller bulkanalyse av celler etter FACS-sortering. Den klare fordelen over tetthetsgradientrensing er at det cellulære lipidinnholdet i hovedsak ikke har noen innvirkning på det effektive utbyttet av hepatocytter. Dermed vil fraksjonen av steatotiske hepatocytter beholdes og inkluderes i nedstrømsanalyser. Dette er ikke bare avgjørende for studiet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Swiss National Fond (prosjektstipend 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
