Test af kræftimmunotermiske lægemidler i en humaniseret musemodel, der bærer humane tumorer
Summary
Denne protokol skitserer dannelsen af humane immunsystemmus (HIS) til immuno-onkologiske undersøgelser. Instruktioner og overvejelser i brugen af denne model til test af humane immunotermiske lægemidler på humane tumorer implanteret i denne model præsenteres med vægt på karakterisering af immunsystemets respons på tumoren.
Abstract
At vende den immunsuppressive karakter af tumormikromiljøet er afgørende for en vellykket behandling af kræft med immunterapilægemidler. Murine cancer modeller er ekstremt begrænsede i deres mangfoldighed og lider af dårlig oversættelse til klinikken. For at tjene som en mere fysiologisk præklinisk model for immunterapistudier er denne protokol udviklet til at evaluere behandlingen af humane tumorer i en mus rekonstitueret med et humant immunsystem. Denne unikke protokol demonstrerer udviklingen af humane immunsystem (HIS, “humaniserede”) mus, efterfulgt af implantation af en human tumor, enten en cellelinjeafledt xenograft (CDX) eller en patientafledt xenograft (PDX). HIS-mus genereres ved at injicere CD34+ humane hæmatopoietiske stamceller isoleret fra navlesnorsblod i neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NOD SIRPα) stærkt immundefekte mus, der også er i stand til at acceptere en xenogenisk tumor. Betydningen af kinetikken og egenskaberne ved udvikling af det menneskelige immunsystem og tumorimplantation understreges. Endelig beskrives en dybdegående evaluering af tumormikromiljøet ved hjælp af flowcytometri. I talrige undersøgelser ved hjælp af denne protokol blev det konstateret, at tumormikromiljøet hos individuelle tumorer rekapituleres i HIS-PDX-mus; “Varme” tumorer udviser stor immuninfiltration, mens “kolde” tumorer ikke gør det. Denne model fungerer som testområde for kombinationsimmunterapier til en bred vifte af humane tumorer og repræsenterer et vigtigt redskab i søgen efter personlig medicin.
Introduction
Musekræftmodeller er vigtige for at etablere grundlæggende mekanismer for tumorvækst og immunflugt. Imidlertid har kræftbehandlingsstudier i musemodeller givet endelig oversættelse til klinikken på grund af begrænsede syngeneiske modeller og artsspecifikke forskelle 1,2. Fremkomsten af immunterapier som en dominerende tilgang til kontrol af tumorer har gentaget behovet for en in vivo-model med et funktionelt humant immunsystem. Fremskridt inden for humane immunsystemmus (HIS-mus) i løbet af det sidste årti har gjort det muligt at studere immuno-onkologi in vivo i en lang række kræfttyper og immunterapeutiske midler 3,4,5,6. Humane tumormodeller, herunder cellelinjeafledte og patientafledte xenotransplantater (henholdsvis CDX og PDX), vokser godt i HIS-mus og er i de fleste tilfælde næsten identiske med deres vækst i den immundeficiente vært, der mangler human hæmatopoietisk engraftment 7,8. Baseret på dette nøglefund har forskere brugt HIS-musemodellen til at studere humane immunterapier, herunder kombinationsterapier designet til at ændre tumormikromiljøet (TME) for at mindske immunsuppression og dermed forbedre immunrettet tumordrab. Disse prækliniske modeller hjælper med at løse problemerne med heterogenitet af humane kræftformer og kan også forudsige behandlingssucces samt overvåge immunrelaterede lægemiddeltoksiciteter 9,10.
Produktionen af en musemodel med et humant immunsystem gennem introduktion af humane hæmatopoietiske stamceller kræver en modtagende immundefekt mus, der ikke afviser xenotransplantatet. Nuværende HIS-musemodeller er afledt af immundefekte musestammer, der blev rapporteret for over 30 år siden. Den første immundeficiente musestamme, der blev beskrevet, var SCID-mus, der manglede T- og B-celler11, efterfulgt af en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfi, der er ansvarlig for musemakrofagtolerance over for humane celler på grund af øget binding for NOD SIRPα-allelen til det humane CD47-molekyle12,13. I begyndelsen af 2000’erne var sletningen af den fælles gammakæde af IL-2-receptoren (IL-2Rγc) på både BALB / c og NOD immundeficiente stammer en game changer for forbedret menneskelig engraftment på grund af genetiske deletioner, der forbød værts NK-celleudvikling14,15,16,17. Alternative modeller, såsom BRG- og NRG-mus, opnår T- og B-cellemangel gennem deletion af Rag1– eller Rag2-genet, der kræves til T- og B-cellereceptorgenomlejringer og dermed modning og overlevelse af lymfocytter18,19. BRGS-musen (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD), der anvendes heri, kombinerer IL-2Rγ-kædemangel ogNOD SIRPα-allelen på Rag2-/- baggrunden, hvilket resulterer i en mus med høj immundefekt mus uden T-, B- eller NK-celler, men alligevel med tilstrækkelig kraft og sundhed til at muliggøre langvarig indkapsling på mere end 30 uger13.
HIS-mus kan genereres på flere måder, hvor human PBMC-injektion er den mest direkte metode15,18,20. Imidlertid har disse mus en markant udvidelse af aktiverede humane T-celler, der resulterer i graft versus host disease (GVHD) ved 12 ugers alderen, hvilket forhindrer langtidsundersøgelser. Alternativt kan humane hæmatopoietiske stamceller fra navlesnorsblod (CB), knoglemarv og føtal lever også bruges til engraftment og produktion af det menneskelige immunsystem de novo. I dette system producerer de hæmatopoietiske stamceller et humant immunsystem med flere afstamninger med generering af T, B og medfødte immunceller, der er vigtige tolerante over for museværten sammenlignet med PBMC-musene, der hovedsagelig udvikler T-celler. Derfor er GVHD fraværende eller stærkt forsinket, og undersøgelser kan udvides til mus op til 10 måneders alderen. CB giver en nem, tilgængelig og ikke-invasiv kilde til CD34+ humane hæmatopoietiske stamceller, der letter indkapsling af flere HIS-mus med genetisk identiske immunsystemer 17,18,20,21. I løbet af de sidste par år er HIS musemodeller blevet brugt i vid udstrækning til at studere immunterapi og TME 3,4,5,6. På trods af udviklingen af humane afledte immunsystemer i disse mus vokser humane xenografttumorer med lignende hastigheder sammenlignet med kontrolimmunodeficiente mus og giver mulighed for det komplekse samspil mellem kræftcellerne og immuncellerne, hvilket er vigtigt for at opretholde mikromiljøet i den indpodede PDX 3,7,8 . Denne protokol er blevet brugt til at udføre over 50 undersøgelser, der tester behandlinger i HIS-BRGS-mus med PDX’er og CDX’er. En vigtig konklusion er, at humane tumorer i HIS-musene opretholder deres unikke TME som defineret ved molekylær evaluering af tumoren i forhold til den oprindelige patientprøve og immuninfiltrategenskaber 3,22,23. Vores gruppe fokuserer på dybdegående evaluering af HIS i både immunorganer og tumoren ved hjælp af multiparameterflowcytometri. Heri beskriver vi en protokol til humanisering af BRGS-mus, evaluering af kimærisme, implantation af humane tumorer, tumorvækstmålinger, kræftbehandlingsadministration og analyse af HIS-cellerne ved flowcytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I løbet af de sidste 6 år har vores forskerteam ved hjælp af vores ekspertise inden for både immunologi og humaniserede mus udviklet en meget tiltrængt præklinisk model til at teste immunterapier på en række humane tumorer 3,7,30,31. Denne protokol understreger overvejelsen af modellens variabilitet med særlig vægt på de immunterapicentrerede humane T-cellepopulationer. I denne proto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke både Animal Research Facility (OLAR) for deres pleje af vores mus og Flow Cytometry Shared Resource støttet af Cancer Center Support Grant (P30CA046934) på vores institut for deres enorme hjælp i alt vores arbejde. Vi anerkender også både Gail Eckhardt og Anna Capasso for vores indledende samarbejde, der studerer immunterapier til humane PDX’er i vores HIS-BRGS-model. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant med brug af PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denne forskning blev delvist støttet af NIAID fra National Institutes of Health under kontraktnummer 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
References
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
