Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren
Summary
Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.
Abstract
Het omkeren van de immunosuppressieve aard van de micro-omgeving van de tumor is van cruciaal belang voor de succesvolle behandeling van kankers met immunotherapiegeneesmiddelen. Murine kankermodellen zijn uiterst beperkt in hun diversiteit en lijden aan een slechte vertaling naar de kliniek. Om te dienen als een meer fysiologisch preklinisch model voor immunotherapiestudies, is dit protocol ontwikkeld om de behandeling van menselijke tumoren te evalueren in een muis gereconstitueerd met een menselijk immuunsysteem. Dit unieke protocol toont de ontwikkeling van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS, “gehumaniseerd”), gevolgd door implantatie van een menselijke tumor, ofwel een cellijn-afgeleide xenograft (CDX) of een patiënt afgeleide xenograft (PDX). HIS-muizen worden gegenereerd door CD34+ menselijke hematopoëtische stamcellen geïsoleerd uit navelstrengbloed te injecteren in neonatale BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) zeer immunodeficiënte muizen die ook in staat zijn om een xenogene tumor te accepteren. Het belang van de kinetiek en kenmerken van de ontwikkeling van het menselijk immuunsysteem en tumorimplantatie wordt benadrukt. Ten slotte wordt een diepgaande evaluatie van de tumormicro-omgeving met behulp van flowcytometrie beschreven. In talrijke studies met dit protocol werd gevonden dat de tumormicro-omgeving van individuele tumoren wordt gerecapituleerd in HIS-PDX-muizen; “Hete” tumoren vertonen grote immuuninfiltratie, terwijl “koude” tumoren dat niet doen. Dit model dient als proeftuin voor combinatie-immunotherapieën voor een breed scala aan menselijke tumoren en vormt een belangrijk hulpmiddel in de zoektocht naar gepersonaliseerde geneeskunde.
Introduction
Muiskankermodellen zijn belangrijk voor het vaststellen van basismechanismen van tumorgroei en immuunvlucht. Kankerbehandelingsstudies in muismodellen hebben echter eindige vertaling naar de kliniek opgeleverd vanwege beperkte syngenetische modellen en soortspecifieke verschillen 1,2. De opkomst van immuuntherapieën als een dominante benadering om tumoren onder controle te houden, heeft de noodzaak van een in vivo model met een functioneel menselijk immuunsysteem herhaald. Vooruitgang in muizen met het menselijk immuunsysteem (HIS-muizen) in het afgelopen decennium heeft het mogelijk gemaakt om immuno-oncologie in vivo te bestuderen in een breed scala aan kankertypen en immunotherapeutische middelen 3,4,5,6. Menselijke tumormodellen, waaronder cellijn-afgeleide en patiënt-afgeleide xenografts (CDX en PDX, respectievelijk), groeien goed in HIS-muizen en zijn in de meeste gevallen bijna identiek aan hun groei in de immunodeficiënte gastheer zonder menselijke hematopoietische engraftment 7,8. Op basis van deze belangrijke bevinding hebben onderzoekers het HIS-muismodel gebruikt om menselijke immunotherapieën te bestuderen, waaronder combinatietherapieën die zijn ontworpen om de tumormicro-omgeving (TME) te veranderen om immunosuppressie te verminderen en zo immuungestuurde tumordoding te verbeteren. Deze preklinische modellen helpen de problemen van heterogeniteit van menselijke kankers aan te pakken en kunnen ook het succes van de behandeling voorspellen en immuungerelateerde geneesmiddeltoxiciteiten monitoren 9,10.
De productie van een muismodel met een menselijk immuunsysteem door de introductie van menselijke hematopoëtische stamcellen vereist een ontvangende immunodeficiënte muis die de xenograft niet zal afstoten. De huidige HIS-muismodellen zijn afgeleid van immunodeficiënte muizenstammen die meer dan 30 jaar geleden werden gerapporteerd. De eerste immunodeficiënte muizenstam die werd beschreven was SCID-muizen zonder T- en B-cellen11, gevolgd door een hybride NOD-SCID met een SIRPα-polymorfisme dat verantwoordelijk is voor muismacrofaagtolerantie voor menselijke cellen, als gevolg van verhoogde binding voor het NOD SIRPα-allel aan het menselijke CD47-molecuul12,13. In de vroege jaren 2000 was de deletie van de gemeenschappelijke gammaketen van de IL-2-receptor (IL-2Rγc) op zowel BALB / c- als NOD-immunodeficiënte stammen een game changer voor verbeterde menselijke transplantatie, vanwege genetische deleties die de ontwikkeling van NK-cellen van de gastheer verbieden14,15,16,17. Alternatieve modellen, zoals BRG- en NRG-muizen, bereiken T- en B-celdeficiëntie door deletie van het Rag1– of Rag2-gen, vereist voor T- en B-celreceptorgenherschikkingen en dus de rijping en overleving van lymfocyten18,19. De BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) muis die hierin wordt gebruikt, combineert de IL-2Rγ-ketendeficiëntie en hetNOD SIRPα-allel op de Rag2-/- achtergrond, wat resulteert in een zeer immunodeficiënte muis zonder T-, B- of NK-cellen, maar met voldoende kracht en gezondheid om langdurige transplantatie van meer dan 30 weken mogelijk te maken13.
HIS-muizen kunnen op meerdere manieren worden gegenereerd, waarbij menselijke PBMC-injectie de meest directe methode is15,18,20. Deze muizen hebben echter een uitgesproken uitbreiding van geactiveerde menselijke T-cellen die resulteert in graft versus host disease (GVHD) op de leeftijd van 12 weken, waardoor langetermijnstudies worden voorkomen. Als alternatief kunnen menselijke hematopoëtische stamcellen uit navelstrengbloed (CB), beenmerg en foetale lever ook worden gebruikt voor transplantatie en productie van het menselijk immuunsysteem de novo. In dit systeem produceren de hematopoëtische stamcellen een multi-lineage menselijk immuunsysteem met de generatie van T, B en aangeboren immuuncellen die belangrijk tolerant zijn voor de muisgastheer, vergeleken met de PBMC-muizen die voornamelijk T-cellen ontwikkelen. Daarom is GVHD afwezig of sterk vertraagd en kunnen studies worden uitgebreid tot muizen tot 10 maanden oud. CB biedt een eenvoudige, toegankelijke en niet-invasieve bron van CD34+ menselijke hematopoëtische stamcellen die de engraftment van meerdere HIS-muizen met genetisch identieke immuunsystemen vergemakkelijkt 17,18,20,21. In de afgelopen jaren zijn HIS-muismodellen uitgebreid gebruikt om immunotherapie en de TME 3,4,5,6 te bestuderen. Ondanks de ontwikkeling van menselijke afgeleide immuunsystemen bij deze muizen, groeien menselijke xenografttumoren met vergelijkbare snelheden in vergelijking met de controle-immunodeficiënte muizen en maken ze het complexe samenspel tussen de kankercellen en immuuncellen mogelijk, wat belangrijk is voor het behoud van de micro-omgeving van de geënte PDX 3,7,8 . Dit protocol is gebruikt om meer dan 50 studies uit te voeren die behandelingen testen in HIS-BRGS-muizen met PDX’s en CDX’s. Een belangrijke conclusie is dat menselijke tumoren in de HIS-muizen hun unieke TME behouden zoals gedefinieerd door moleculaire evaluatie van de tumor ten opzichte van het initiële patiëntmonster en immuuninfiltraatkenmerken 3,22,23. Onze groep richt zich op een diepgaande evaluatie van de HIS in zowel immuunorganen als de tumor met behulp van multi-parameter flowcytometrie. Hierin beschrijven we een protocol voor de humanisatie van BRGS-muizen, evaluatie van chimerisme, implantatie van menselijke tumoren, tumorgroeimetingen, toediening van kankerbehandeling en analyse van de HIS-cellen door flowcytometrie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen 6 jaar heeft ons onderzoeksteam, gebruikmakend van onze expertise in zowel immunologie als gehumaniseerde muizen, een broodnodig preklinisch model ontwikkeld om immunotherapieën te testen op een verscheidenheid aan menselijke tumoren 3,7,30,31. Dit protocol benadrukt de overweging van de variabiliteit van het model, met speciale aandacht voor de immunotherapie-centrische mensel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen zowel de Animal Research Facility (OLAR) bedanken voor hun zorg voor onze muizen, als de Flow Cytometry Shared Resource ondersteund door de Cancer Center Support Grant (P30CA046934) op ons instituut voor hun immense hulp bij al ons werk. We erkennen ook zowel Gail Eckhardt als Anna Capasso voor onze inaugurele samenwerkingen met immunotherapieën voor menselijke PDX’s in ons HIS-BRGS-model. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant met behulp van de PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Dit onderzoek werd mede mogelijk gemaakt door de NIAID van de National Institutes of Health onder contractnummer 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
References
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
