בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS) עבור מחקרים אימונו-אונקולוגיים. הוראות ושיקולים בשימוש במודל זה לבדיקת אימונותרפיה אנושית על גידולים אנושיים המושתלים במודל זה מוצגים בדגש על אפיון התגובה של מערכת החיסון האנושית לגידול.
Abstract
היפוך האופי החיסוני של המיקרו-סביבה של הגידול הוא קריטי לטיפול מוצלח בסרטן באמצעות תרופות אימונותרפיות. מודלים של סרטן מורין מוגבלים מאוד במגוון שלהם וסובלים מתרגום לקוי למרפאה. כדי לשמש מודל פרה-קליני פיזיולוגי יותר למחקרים אימונותרפיים, פרוטוקול זה פותח כדי להעריך את הטיפול בגידולים אנושיים בעכבר שהורכב מחדש עם מערכת החיסון האנושית. פרוטוקול ייחודי זה מדגים התפתחות של עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS, “אנושיים”), ולאחר מכן השתלה של גידול אנושי, או xenograft נגזר קו התא (CDX) או xenograft נגזר המטופל (PDX). העכברים שלו נוצרים על ידי הזרקת CD34+ תאי גזע המטופויטיים אנושיים שבודדו מדם טבורי לתוך BRGS בילוד (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) עכברים בעלי כשל חיסוני גבוה המסוגלים גם לקבל גידול קסנוגני. מודגשת חשיבות הקינטיקה ומאפייני התפתחות מערכת החיסון האנושית והשתלת הגידול. לבסוף, מתוארת הערכה מעמיקה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות ציטומטריית זרימה. במחקרים רבים המשתמשים בפרוטוקול זה, נמצא כי מיקרו-סביבה של גידולים בודדים משוחזרת בעכברי HIS-PDX; גידולים “חמים” מציגים חדירה חיסונית גדולה בעוד גידולים “קרים” לא. מודל זה משמש כשדה ניסויים לאימונותרפיה משולבת למגוון רחב של גידולים אנושיים ומהווה כלי חשוב בחיפוש אחר רפואה מותאמת אישית.
Introduction
מודלים של סרטן עכברים חשובים לביסוס מנגנונים בסיסיים של צמיחת הגידול ובריחה חיסונית. עם זאת, מחקרי טיפול בסרטן במודלים של עכברים הניבו תרגום סופי למרפאה בשל מודלים סינגניים מוגבלים והבדלים ספציפיים למין 1,2. הופעתם של טיפולים חיסוניים כגישה דומיננטית לשליטה בגידולים חזרה על הצורך במודל in vivo עם מערכת חיסון אנושית מתפקדת. ההתקדמות בעכברי מערכת החיסון האנושית (עכברי HIS ) בעשור האחרון אפשרה לחקור אימונו-אונקולוגיה in vivo במגוון רחב של סוגי סרטן וחומרים אימונותרפיים 3,4,5,6. מודלים של גידולים אנושיים, כולל xenografts שמקורם בקו תאים וקסנוגרפטים שמקורם בחולה (CDX ו-PDX, בהתאמה), גדלים היטב בעכברי HIS וברוב המקרים כמעט זהים לגידולם בפונדקאי החיסוני חסר קליטה המטופויטית אנושית 7,8. בהתבסס על ממצא מפתח זה, חוקרים השתמשו במודל העכבר HIS כדי לחקור אימונותרפיות אנושיות, כולל טיפולים משולבים שנועדו לשנות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME) כדי להפחית את הדיכוי החיסוני ובכך להגביר את הרג הגידול המכוון על ידי מערכת החיסון. מודלים פרה-קליניים אלה מסייעים לטפל בבעיות של הטרוגניות של סרטן אנושי, ויכולים גם לחזות הצלחה בטיפול, כמו גם לעקוב אחר רעילות תרופות הקשורות למערכת החיסון 9,10.
ייצור מודל עכבר עם מערכת חיסון אנושית באמצעות הכנסת תאי גזע המטופויטיים אנושיים דורש עכבר מושתל מדוכא חיסון שלא ידחה את הקסנוגרפט. המודלים הנוכחיים של עכברי HIS נגזרים מזני עכברים מדוכאי חיסון שדווחו לפני יותר מ-30 שנה. זן העכבר הראשון עם כשל חיסוני שתואר היה עכברי SCID שהיו חסרים תאי T ו-B11, ואחריו NOD-SCID היברידי עם פולימורפיזם SIRPα האחראי לסבילות מקרופאגים של עכברים לתאים אנושיים, עקב קשירה מוגברת של אלל NOD SIRPα למולקולת CD47 האנושית12,13. בתחילת שנות ה-2000, מחיקת שרשרת הגמא הנפוצה של קולטן IL-2 (IL-2Rγc) בשני הזנים BALB/c ו-NOD שינתה את כללי המשחק עבור קליטה אנושית משופרת, עקב מחיקות גנטיות שאסרו על התפתחות תאי NK מארחים14,15,16,17. מודלים חלופיים, כגון עכברי BRG ו-NRG, משיגים מחסור בתאי T ו-B באמצעות מחיקה של הגן Rag1 או Rag2, הדרוש לסידור מחדש של גנים של קולטני תאי T ו-B ובכך להבשלה והישרדות של לימפוציטים18,19. עכבר BRGS (BALB/c -Rag2 null Il2R γCnullSirpα NOD) המשמש כאן משלב את חסר שרשרת IL-2Rγ ואת אללNOD SIRPα על רקע Rag2-/- וכתוצאה מכך עכבר בעל כשל חיסוני גבוה ללא תאי T, B או NK, אך עם מספיק מרץ ובריאות כדי לאפשר קליטה לטווח ארוך של יותר מ -30 שבועות13.
עכברי HIS יכולים להיווצר בדרכים רבות, כאשר הזרקת PBMC אנושית היא השיטה הישירה ביותר15,18,20. עם זאת, לעכברים אלה יש התרחבות בולטת של תאי T אנושיים פעילים שגורמת למחלת השתל לעומת המאכסן (GVHD) עד גיל 12 שבועות, מה שמונע מחקרים ארוכי טווח. לחלופין, תאי גזע המטופויטיים אנושיים מדם טבורי (CB), מח עצם וכבד עוברי יכולים לשמש גם לקליטה וייצור של מערכת החיסון האנושית דה נובו. במערכת זו, תאי הגזע ההמטופויטיים מייצרים מערכת חיסון אנושית מרובת שושלות עם דור של תאי T, B, ותאי חיסון מולדים שהם סובלניים מאוד לפונדקאי העכבר, בהשוואה לעכברי PBMC שמפתחים בעיקר תאי T. לכן, GVHD נעדר או מתעכב מאוד, וניתן להרחיב את הלימודים לעכברים עד גיל 10 חודשים. CB מספק מקור קל, נגיש ולא פולשני של תאי גזע המטופויטיים אנושיים CD34+ המאפשר השתלה של עכברי HIS מרובים עם מערכת חיסון זהה גנטית 17,18,20,21. במהלך השנים האחרונות, מודלים של עכברי HIS שימשו באופן נרחב לחקר אימונותרפיה ו- TME 3,4,5,6. למרות התפתחות מערכת החיסון שמקורה בבני אדם בעכברים אלה, גידולי קסנוגרפט אנושיים גדלים בקצב דומה בהשוואה לעכברי ביקורת מדוכאי חיסון ומאפשרים את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי הסרטן לתאי מערכת החיסון, החשובה לשמירה על המיקרו-סביבה של PDX 3,7,8 המושתל . פרוטוקול זה שימש לביצוע למעלה מ-50 מחקרים שבדקו טיפולים בעכברי HIS-BRGS עם PDX ו-CDX. מסקנה חשובה היא שגידולים אנושיים בעכברי HIS שומרים על ה-TME הייחודי שלהם כפי שהוגדר על ידי הערכה מולקולרית של הגידול ביחס לדגימת החולה הראשונית ומאפייני החדירה החיסונית 3,22,23. הקבוצה שלנו מתמקדת בהערכה מעמיקה של HIS הן באיברי החיסון והן בגידול באמצעות ציטומטריית זרימה מרובת פרמטרים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להומניזציה של עכברי BRGS, הערכת כימריזם, השתלת גידולים אנושיים, מדידות גדילת גידולים, מתן טיפול בסרטן וניתוח תאי HIS לפי ציטומטריית זרימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך 6 השנים האחרונות, תוך שימוש במומחיות שלנו הן באימונולוגיה והן בעכברים אנושיים, צוות המחקר שלנו פיתח מודל פרה-קליני נחוץ מאוד לבדיקת אימונותרפיה על מגוון גידולים אנושיים 3,7,30,31. פרוטוקול זה מדגיש את ההתחשבות בשונות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות הן למתקן לחקר בעלי חיים (OLAR) על הטיפול בעכברים שלנו, והן למשאב המשותף של Flow Cytometry הנתמך על ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן (P30CA046934) במכון שלנו על עזרתם העצומה בכל עבודתנו. אנו מודים גם לגייל אקהרדט ולאנה קאפאסו על שיתוף הפעולה הראשון שלנו בחקר אימונותרפיה לחולי PDX אנושיים במודל HIS-BRGS שלנו. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן P30CA06934 של המכונים הלאומיים לבריאות עם שימוש במשאב המשותף PHISM (מודלים פרה-קליניים של עכברי מערכת החיסון האנושית), RRID: SCR_021990 ו- Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי NIAID של המכונים הלאומיים לבריאות תחת חוזה מספר 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
References
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
