Test di immunoterapie del cancro in un modello murino umanizzato che porta tumori umani
Summary
Questo protocollo delinea la generazione di topi del sistema immunitario umano (HIS) per studi immuno-oncologici. Le istruzioni e le considerazioni nell’uso di questo modello per testare immunoterapici umani su tumori umani impiantati in questo modello sono presentate con un’enfasi sulla caratterizzazione della risposta del sistema immunitario umano al tumore.
Abstract
Invertire la natura immunosoppressiva del microambiente tumorale è fondamentale per il successo del trattamento dei tumori con farmaci immunoterapici. I modelli di cancro murino sono estremamente limitati nella loro diversità e soffrono di scarsa traduzione in clinica. Per servire come modello preclinico più fisiologico per gli studi di immunoterapia, questo protocollo è stato sviluppato per valutare il trattamento dei tumori umani in un topo ricostituito con un sistema immunitario umano. Questo protocollo unico dimostra lo sviluppo di topi del sistema immunitario umano (HIS, “umanizzati”), seguito dall’impianto di un tumore umano, sia uno xenotrapianto derivato da linea cellulare (CDX) o uno xenotrapianto derivato dal paziente (PDX). I topi HIS sono generati iniettando cellule staminali ematopoietiche umane CD34 + isolate dal sangue del cordone ombelicale in topi neonatali BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) altamente immunodeficienti che sono anche in grado di accettare un tumore xenogenico. Viene sottolineata l’importanza della cinetica e delle caratteristiche dello sviluppo del sistema immunitario umano e dell’impianto del tumore. Infine, viene descritta una valutazione approfondita del microambiente tumorale mediante citometria a flusso. In numerosi studi che utilizzano questo protocollo, è stato riscontrato che il microambiente tumorale dei singoli tumori è ricapitolato nei topi HIS-PDX; I tumori “caldi” mostrano una grande infiltrazione immunitaria mentre i tumori “freddi” no. Questo modello funge da banco di prova per le immunoterapie combinate per una vasta gamma di tumori umani e rappresenta uno strumento importante nella ricerca di una medicina personalizzata.
Introduction
I modelli di cancro del topo sono importanti per stabilire i meccanismi di base della crescita tumorale e della fuga immunitaria. Tuttavia, gli studi sul trattamento del cancro in modelli murini hanno prodotto una traduzione finita alla clinica a causa dei limitati modelli singeneici e delle differenze specie-specifiche 1,2. L’emergere di terapie immunitarie come approccio dominante per controllare i tumori ha ribadito la necessità di un modello in vivo con un sistema immunitario umano funzionale. I progressi nei topi del sistema immunitario umano (topi HIS) negli ultimi dieci anni hanno reso possibile studiare l’immuno-oncologia in vivo in un’ampia varietà di tipi di cancro e agenti immunoterapeutici 3,4,5,6. I modelli tumorali umani, compresi gli xenotrapianti derivati da linee cellulari e derivati dal paziente (CDX e PDX, rispettivamente), crescono bene nei topi HIS e nella maggior parte dei casi sono quasi identici alla loro crescita nell’ospite immunodeficiente privo di attecchimento ematopoietico umano 7,8. Sulla base di questa scoperta chiave, i ricercatori hanno utilizzato il modello murino HIS per studiare le immunoterapie umane, comprese le terapie combinate progettate per alterare il microambiente tumorale (TME) per ridurre l’immunosoppressione e quindi migliorare l’uccisione del tumore diretta dal sistema immunitario. Questi modelli preclinici aiutano ad affrontare i problemi di eterogeneità dei tumori umani e possono anche prevedere il successo del trattamento e monitorare la tossicità dei farmaci correlati al sistema immunitario 9,10.
La produzione di un modello murino con un sistema immunitario umano attraverso l’introduzione di cellule staminali ematopoietiche umane richiede un topo immunodeficiente ricevente che non respinga lo xenotrapianto. Gli attuali modelli murini HIS derivano da ceppi murini immunodeficienti che sono stati segnalati oltre 30 anni fa. Il primo ceppo di topo immunodeficiente descritto erano topi SCID privi di cellule T e B11, seguiti da un ibrido NOD-SCID con un polimorfismo SIRPα responsabile della tolleranza dei macrofagi di topo alle cellule umane, a causa dell’aumento del legame per l’allele NOD SIRPα alla molecola umana CD4712,13. Nei primi anni 2000, la delezione della catena gamma comune del recettore IL-2 (IL-2Rγc) su entrambi i ceppi immunodeficienti BALB / c e NOD è stato un punto di svolta per l’attecchimento umano potenziato, a causa delle delezioni genetiche che vietano lo sviluppo delle cellule NK dell’ospite14,15,16,17. Modelli alternativi, come i topi BRG e NRG, raggiungono il deficit delle cellule T e B attraverso la delezione del gene Rag1 o Rag2, richiesto per i riarrangiamenti genici dei recettori delle cellule T e B e quindi la maturazione e la sopravvivenza dei linfociti18,19. Il topo BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) qui utilizzato combina il deficit della catena IL-2Rγ e l’alleleNOD SIRPα sullo sfondo Rag2-/-, risultando in un topo altamente immunodeficiente senza cellule T, B o NK, ma con sufficiente vigore e salute per consentire un attecchimento a lungo termine di oltre 30 settimane13.
I topi HIS possono essere generati in diversi modi, con l’iniezione umana di PBMC che è il metodo più diretto15,18,20. Tuttavia, questi topi hanno una pronunciata espansione delle cellule T umane attivate che si traduce in malattia del trapianto contro l’ospite (GVHD) entro le 12 settimane di età, impedendo studi a lungo termine. In alternativa, le cellule staminali ematopoietiche umane dal sangue del cordone ombelicale (CB), dal midollo osseo e dal fegato fetale possono anche essere utilizzate per l’attecchimento e la produzione del sistema immunitario umano de novo. In questo sistema, le cellule staminali ematopoietiche producono un sistema immunitario umano multi-lignaggio con la generazione di T, B e cellule immunitarie innate che sono significativamente tolleranti dell’ospite del topo, rispetto ai topi PBMC che sviluppano principalmente cellule T. Pertanto, la GVHD è assente o molto ritardata e gli studi possono essere estesi a topi fino a 10 mesi di età. CB fornisce una fonte facile, accessibile e non invasiva di cellule staminali ematopoietiche umane CD34+ che facilita l’attecchimento di più topi HIS con sistemi immunitari geneticamente identici 17,18,20,21. Negli ultimi anni, i modelli murini HIS sono stati ampiamente utilizzati per studiare l’immunoterapia e la TME 3,4,5,6. Nonostante lo sviluppo di sistemi immunitari di derivazione umana in questi topi, i tumori dello xenotrapianto umano crescono a tassi simili rispetto ai topi immunodeficienti di controllo e consentono la complessa interazione tra le cellule tumorali e le cellule immunitarie, che è importante per mantenere il microambiente delPDX 3,7,8 innestato . Questo protocollo è stato utilizzato per eseguire oltre 50 studi testando trattamenti in topi HIS-BRGS con PDX e CDX. Una conclusione importante è che i tumori umani nei topi HIS mantengono la loro unica TME come definito dalla valutazione molecolare del tumore rispetto al campione iniziale del paziente e alle caratteristiche dell’infiltrato immunitario 3,22,23. Il nostro gruppo si concentra sulla valutazione approfondita dell’HIS sia negli organi immunitari che nel tumore utilizzando la citometria a flusso multiparametrica. Qui, descriviamo un protocollo per l’umanizzazione dei topi BRGS, la valutazione del chimerismo, l’impianto di tumori umani, le misurazioni della crescita tumorale, la somministrazione del trattamento del cancro e l’analisi delle cellule HIS mediante citometria a flusso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Negli ultimi 6 anni, utilizzando la nostra esperienza sia in immunologia che nei topi umanizzati, il nostro team di ricerca ha sviluppato un modello preclinico molto necessario per testare le immunoterapie su una varietà di tumori umani 3,7,30,31. Questo protocollo enfatizza la considerazione della variabilità del modello, con particolare attenzione alle popolazioni di cellule T umane incentr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare sia l’Animal Research Facility (OLAR) per la loro cura dei nostri topi, sia la risorsa condivisa di citometria a flusso supportata dal Cancer Center Support Grant (P30CA046934) presso il nostro istituto per il loro immenso aiuto in tutto il nostro lavoro. Riconosciamo anche Gail Eckhardt e Anna Capasso per le nostre collaborazioni inaugurali che studiano le immunoterapie per PDX umani nel nostro modello HIS-BRGS. Questo studio è stato supportato in parte dal National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant con l’uso della risorsa condivisa PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models), RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal NIAID del National Institutes of Health con il numero di contratto 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
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