Cancer Research

Test d’immunothérapies anticancéreuses dans un modèle murin humanisé portant des tumeurs humaines

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606

Jordi M. Lanis*¹, Matthew S. Lewis*¹, Hannah Strassburger¹, Kristina Larsen¹, Stacey M. Bagby², Adrian T. A. Dominguez², Juan A. Marín-Jiménez³, Roberta Pelanda¹, Todd M. Pitts², Julie Lang¹

¹Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, ²Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, ³Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)

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Summary

Ce protocole décrit la génération de souris du système immunitaire humain (SIH) pour les études d’immuno-oncologie. Les instructions et les considérations relatives à l’utilisation de ce modèle pour tester les immunothérapies humaines sur les tumeurs humaines implantées dans ce modèle sont présentées en mettant l’accent sur la caractérisation de la réponse du système immunitaire humain à la tumeur.

Abstract

L’inversion de la nature immunosuppressive du microenvironnement tumoral est essentielle au succès du traitement des cancers avec des médicaments d’immunothérapie. Les modèles de cancer murin sont extrêmement limités dans leur diversité et souffrent d’une mauvaise traduction à la clinique. Pour servir de modèle préclinique plus physiologique pour les études d’immunothérapie, ce protocole a été développé pour évaluer le traitement des tumeurs humaines chez une souris reconstituée avec un système immunitaire humain. Ce protocole unique démontre le développement de souris du système immunitaire humain (HIS, « humanisé »), suivi de l’implantation d’une tumeur humaine, soit une xénogreffe dérivée d’une lignée cellulaire (CDX), soit une xénogreffe dérivée du patient (PDX). Les souris HIS sont générées par l’injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ isolées du sang de cordon ombilical dans des souris BRGS néonatales (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-^/- NOD^SIRPα) hautement immunodéficientes qui sont également capables d’accepter une tumeur xénogénique. L’importance de la cinétique et des caractéristiques du développement du système immunitaire humain et de l’implantation tumorale est soulignée. Enfin, une évaluation approfondie du microenvironnement tumoral à l’aide de la cytométrie en flux est décrite. Dans de nombreuses études utilisant ce protocole, il a été constaté que le microenvironnement tumoral des tumeurs individuelles est récapitulé chez les souris HIS-PDX; Les tumeurs « chaudes » présentent une infiltration immunitaire importante alors que les tumeurs « froides » ne le font pas. Ce modèle sert de terrain d’essai pour les immunothérapies combinées pour un large éventail de tumeurs humaines et représente un outil important dans la quête de la médecine personnalisée.

Introduction

Les modèles de cancer de la souris sont importants pour établir les mécanismes de base de la croissance tumorale et de l’évasion immunitaire. Cependant, les études sur le traitement du cancer sur des modèles murins ont donné une traduction finie à la clinique en raison des modèles syngéniques limités et des différences spécifiques à l’espèce ^1,2. L’émergence des thérapies immunitaires en tant qu’approche dominante pour contrôler les tumeurs a réitéré la nécessité d’un modèle in vivo avec un système immunitaire humain fonctionnel. Les progrès réalisés chez les souris du système immunitaire humain (souris HIS) au cours de la dernière décennie ont permis d’étudier l’immuno-oncologie in vivo dans une grande variété de types de cancer et d’agents immunothérapeutiques 3,4,5,6. Les modèles tumoraux humains, y compris les xénogreffes dérivées de lignées cellulaires et de patients (CDX et PDX, respectivement), se développent bien chez les souris HIS et, dans la plupart des cas, sont presque identiques à leur croissance chez l’hôte immunodéficient dépourvu de greffe hématopoïétique humaine ^7,8. Sur la base de cette découverte clé, les chercheurs ont utilisé le modèle murin HIS pour étudier les immunothérapies humaines, y compris les thérapies combinées conçues pour modifier le microenvironnement tumoral (TME) afin de diminuer l’immunosuppression et ainsi améliorer la destruction tumorale dirigée par le système immunitaire. Ces modèles précliniques aident à résoudre les problèmes d’hétérogénéité des cancers humains et peuvent également prédire le succès du traitement ainsi que surveiller les toxicités médicamenteuses liées au système immunitaire ^9,10.

La production d’un modèle murin avec un système immunitaire humain par l’introduction de cellules souches hématopoïétiques humaines nécessite une souris immunodéficiente receveuse qui ne rejettera pas la xénogreffe. Les modèles murins HIS actuels sont dérivés de souches de souris immunodéficientes qui ont été signalées il y a plus de 30 ans. La première souche de souris immunodéficiente décrite était des souris SCID dépourvues de cellules T et B¹¹, suivies d’un hybride NOD-SCID avec un polymorphisme SIRPα responsable de la tolérance des macrophages de souris aux cellules humaines, en raison de la liaison accrue de l’allèle NOD SIRPα à la molécule CD47^{humaine 12,13}. Au début des années 2000, la suppression de la chaîne gamma commune du récepteur IL-2 (IL-2Rγc) sur les souches immunodéficientes BALB/c et NOD a changé la donne pour une greffe humaine améliorée, en raison de délétions génétiques interdisant le développement des cellules NK de l’hôte^14,15,16,17. Des modèles alternatifs, tels que les souris BRG et NRG, permettent d’obtenir un déficit en lymphocytes T et B par délétion du gène Rag1 ou Rag2, nécessaire aux réarrangements des gènes des récepteurs des cellules T et B et donc à la maturation et à la survie des lymphocytes^18,19. La souris BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγC^nullSirpα^NOD) utilisée ici combine le déficit en chaîne IL-2Rγ et l’allèle NOD SIRPα sur le fond Rag2-/-, résultant en une souris hautement immunodéficiente sans cellules T, B ou NK, mais avec une vigueur et une santé suffisantes pour permettre une greffe à long terme de plus de 30 semaines¹³.

Les souris HIS peuvent être générées de multiples façons, l’injection humaine de PBMC étant la méthode la plus directe^15,18,20. Cependant, ces souris ont une expansion prononcée des cellules T humaines activées qui entraîne la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) à l’âge de 12 semaines, empêchant les études à long terme. Alternativement, les cellules souches hématopoïétiques humaines du sang de cordon ombilical (CB), de la moelle osseuse et du foie fœtal peuvent également être utilisées pour la greffe et la production du système immunitaire humain de novo. Dans ce système, les cellules souches hématopoïétiques produisent un système immunitaire humain multi-lignée avec la génération de cellules immunitaires T, B et innées qui sont particulièrement tolérantes envers l’hôte souris, par rapport aux souris PBMC qui développent principalement des cellules T. Par conséquent, la GVH est absente ou considérablement retardée, et les études peuvent être étendues aux souris jusqu’à l’âge de 10 mois. Le CB fournit une source facile, accessible et non invasive de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ qui facilite la greffe de plusieurs souris HIS ayant un système immunitaire génétiquement identique 17,18,20,21. Au cours des dernières années, les modèles murins HIS ont été largement utilisés pour étudier l’immunothérapie et le TME 3,4,5,6. Malgré le développement de systèmes immunitaires dérivés de l’homme chez ces souris, les tumeurs de xénogreffe humaine se développent à des taux similaires à ceux des souris immunodéficientes témoins et permettent l’interaction complexe entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires, ce qui est important pour maintenir le microenvironnement du PDX ^3,7,8 greffé . Ce protocole a été utilisé pour réaliser plus de 50 études testant des traitements chez des souris HIS-BRGS avec PDX et CDX. Une conclusion importante est que les tumeurs humaines chez les souris HIS maintiennent leur TME unique tel que défini par l’évaluation moléculaire de la tumeur par rapport à l’échantillon initial du patient et aux caractéristiques de l’infiltrat immunitaire 3,22,23. Notre groupe se concentre sur l’évaluation approfondie du HIS dans les organes immunitaires et la tumeur à l’aide de la cytométrie de flux multiparamétrique. Nous décrivons ici un protocole pour l’humanisation des souris BRGS, l’évaluation du chimérisme, l’implantation de tumeurs humaines, les mesures de croissance tumorale, l’administration de traitements contre le cancer et l’analyse des cellules HIS par cytométrie en flux.

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Protocol

Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Denver (protocoles IACUC #00593 et #00021). Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément à l’Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), un établissement accrédité par l’American Association for Laboratory Animal Care, au campus médical Anschutz de l’Université du Colorado à Denver. Tous les échantillons de sang de cordon humain ont été prélevés sous forme de dons de donneurs anonymisés et ne sont donc pas assujettis à l’approbation du comité d’éthique de la recherche sur des sujets humains.

REMARQUE : Les compositions de tous les supports et solutions mentionnés dans le protocole sont incluses dans le dossier supplémentaire 1. La figure 1 illustre le protocole global de génération et d’analyse des réponses immunitaires aux tumeurs chez les souris HIS-BRGS.

1. Génération de souris HIS

Élevage de souris BALB/c -Rag2 null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS)
REMARQUE: Cette souche est extrêmement immunodéficiente, sans cellules T, B ou NK. Par conséquent, des mesures rigoureuses doivent être utilisées pour prévenir les infections opportunistes. Maintenir la colonie sur un régime contenant du triméthoprime et de la sulfadiazine sur un calendrier alterné de 2 semaines avec un régime normal. Maintenir le plus haut niveau possible de salle de logement par précaution (p. ex., une installation de douche à barrière avec un accès limité).
1. Maintenir les colonies de souris homozygotes BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) et BALB/c Rag2 null Il2RγC ^null Sirpa^Balb/c (BRG) homozygotes comme reproducteurs.
2. Breed BRGS N/N×BRG B/B^pourgénérer des petits BRGS^B/N, à utiliser comme receveurs de cellules souches humaines. Dans cette colonie, les BRGS^B/N sont en meilleure santé que les BRGS N^/N, et se greffent à des niveaux équivalents (plus que BRG).
Isolement de cellules souches humaines CD34+ à partir de CB ombilical
REMARQUE: Aucun antibiotique n’est utilisé pour cette procédure. Par conséquent, une bonne technique stérile est impérative.
1. Placez une grille à tubes coniques de 50 mL, ainsi que 3 tubes coniques de 15 ml et ~10 x 50 ml dans une enceinte de biosécurité stérilisée (ESB). Vaporisez un sac de prélèvement sanguin avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le sécher dans l’ESB.
2. Calculer le nombre de tubes coniques de 50 mL requis pour l’isolement du gradient de densité CB = volume CB/15, arrondi vers le haut et à un nombre de tubes pairs. Calculer le volume sanguin par tube = volume CB/nombre de tubes. Versez soigneusement le sang du sac CB dans chaque tube conique; il s’agit d’un maximum de 15 mL par tube. Utilisez une pipette automatique et une pipette sérologique de 25 ml pour mélanger le sang 1:1 avec du PBS stérile en pipetant de haut en bas.
3. Utilisez une pipette automatique à basse vitesse et une pipette sérologique de 10 mL pour recouvrir lentement le sang d’une solution à gradient de densité de 1,077 g/mL à température ambiante (RT) (voir le tableau des matières) sans perturber l’interface. Empêchez l’embout de la pipette de toucher le fond du tube. Répétez l’opération pour tous les tubes. Puis centrifuger pendant 30 min à 850 x g, sans freinage, à RT pour assurer le maintien du gradient de densité.
4. Visualisez la couche leucocytaire cellulaire au-dessus du gradient de densité de 1,077 g/mL sous la forme d’une couche blanche trouble. Retirer et jeter la couche de plasma jusqu’à environ 10 mL au-dessus de la couche leucocytaire à l’aide d’une pipette sérologique de 25 mL et d’un pipetor automatique.
5. Recueillir la couche leucocytaire avec un transfert stérile ou une pipette sérologique. Utilisez la pipette comme une spatule pour gratter les cellules sur le côté du tube conique tout en relâchant le bulbe (ou en pipetant lentement) pour aspirer les cellules vers le haut. Combiner les couches leucocytaires de deux tubes coniques de 50 ml en un nouveau tube conique de 50 ml.
6. Lavez les cellules en versant 45 mL de HBSS stérile contenant 2% de FBS dans chaque tube conique. Centrifuger pendant 11 min à 360 x g à TA.
7. Aspirer le fluide de lavage jusqu’au granulé dans tous les tubes. Utilisez une pipette sérologique de 10 mL et une pipette automatique pour remettre en suspension la première pastille dans 10 mL de HBSS contenant 2 % de FBS. Remettez chaque pastille en suspension dans les mêmes 10 mL de HBSS et rincez chaque tube avec 10 mL supplémentaires de HBSS pour recueillir toutes les cellules dans un seul tube.
8. Verser 45 mL d’HBSS stérile contenant 2% de FBS dans le tube conique. Centrifuger pendant 10 min à 360 x g, à 4 °C.
9. Aspirer le tampon de lavage jusqu’à la pastille de la cellule et remettre en suspension la pastille dans 20 ml de tampon séparateur de cellules magnétiques (voir le tableau des matériaux). Prélever une petite partie aliquote pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre à une dilution de 1:20 dans du bleu de méthylène. Ajoutez le nombre de cellules bleues et blanches. Centrifuger à 360 x g, pendant 10 min à 4 °C.
  REMARQUE : Ce protocole utilise la technologie des billes magnétiques (voir le tableau des matériaux). Le protocole peut être modifié pour être utilisé avec n’importe quelle technologie de séparation cellulaire, avec une pureté et un rendement suffisants des cellules souches CD34+.
10. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellules CD34+ isolée du sang de cordon ombilical dans 300 μL de tampon séparateur de cellules magnétiques par 1 x 10⁸ cellules. Ajouter d’abord 100 μL de réactif bloquant le FcR, puis 100 μL de billes magnétiques CD34+ par 1 x 10⁸ cellules. Incuber à 4 °C pendant 30 min (sans glace).
11. Ajouter 5 mL de tampon séparateur de cellules magnétiques par 1 x 10⁸ cellules et faire tourner à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Répéter l’étape de lavage et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon séparateur de cellules magnétiques par 1 x 10⁸ cellules dans un tube conique de 15 mL étiqueté « non fractionné ».
12. Étiquetez deux autres tubes coniques de 15 mL « CD34- » et « CD34+ ». Placez les trois tubes coniques de 15 ml (non fractionnés, CD34 et CD34+) dans les fentes A1, B1 et C1, respectivement, sur une grille de refroidissement (voir le tableau des matériaux). Séparer les cellules à l’aide du programme de sélection positive à deux colonnes d’un séparateur automatique de cellules magnétiques (voir le tableau des matériaux) dans une ESB, conformément aux instructions de l’instrument du fabricant.
Expansion et congélation de cellules souches humaines CD34+
1. Aliquote 10 μL de la suspension cellulaire CD34+ récupérée (2 mL) sur une lame d’hémocytomètre et compter les cellules sous grossissement 10x. Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 2 x 10⁴. Divisez le nombre total de cellules CD34+ par 250 000 pour calculer le nombre de flacons à congeler (50 000 cellules par bébé de souris avant l’expansion in vitro ).
2. Préparer le milieu CB à 10 % de FCS d’Iscove (plus 1 mL supplémentaire pour la perte de filtrage), complété par 40 ng/mL de facteur de cellules souches, 20 ng/mL de Flt3L et 10 ng/mL d’IL-6, et passer à travers un filtre de 0,22 μm. Resuspendre les cellules CD34+ à 100 000 par mL de milieu CB et incuber à 37 °C. Le jour 3, ajouter un volume équivalent de milieu CB sans cytokines dans la fiole contenant les cellules et le milieu CB avec cytokines.
  REMARQUE : L’ajout de ces cytokines au milieu CB favorise la survie et l’expansion des cellules CD34+ tout en empêchant la différenciation.
3. Récoltez les cellules CD34+ expansées au jour 5. Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas et recueillir dans un tube conique de 50 mL. Ajouter suffisamment de milieu CB pour couvrir le fond de la fiole. À l’aide d’un grattoir à cellules, gratter tout le fond de la fiole. Recueillir tous les milieux dans le même tube de 50 ml et centrifuger à 360 x g pendant 11 min.
4. Remettez les cellules en suspension dans 2 mL de milieu CB. Conservez la goutte finale de la pipette dans une plaque de 96 puits pour le comptage. Diluer les cellules 1:1 dans du bleu de trypan et ajouter 10 μL à l’hémocytomètre, puis compter et faire la moyenne des cellules à partir de quatre quadrants. Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 4 x 10⁴ et notez la viabilité.
5. Faire n + 1 mL de milieu de congélation, où n est le nombre de flacons congelés calculé à l’étape 1.3.1. Préparer le milieu de congélation en ajoutant 10 % (v/v) de DMSO au FBS et garder sur la glace. Étiquetez les cryoflacons avec CB#, CD34+ d5 et date.
6. Faire tourner les cellules CD34+ à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le milieu jusqu’à la pastille et remettre en suspension le granulé de cellule dans un milieu de congélation. Aliquote 1 mL de suspension cellulaire dans chaque flacon et répartir le reste uniformément entre les flacons. Ajouter les flacons dans un congélateur à cellules isopropanol refroidis à 4 °C, placer à -80 °C et transférer dans de l’azote liquide pour conserver pendant >90 jours.
Irradiation des bébés souris
1. Rassemblez les chiots BRGS^B/N , 1 à 3 jours après la naissance, dans une boîte en plastique autoclavée avec rembourrage. Ajoutez une petite quantité de litière avec les chiots. Étiquetez la boîte avec le numéro de la cage et le nombre de chiots.
2. Installer l’irradiateur (voir le tableau des matières) pour une dose de 300 rad. Placez la boîte de chiots dans l’irradiateur et exposez-les à 300 rad. Ramenez les chiots dans leur cage, placez-les en tas et couvrez-les de litière.
Injections de chiots et préparation de cellules CD34+
1. Commencer la préparation des cellules CD34+ ~3 h après l’irradiation. Réchauffer 10 mL de média CB dans un tube conique de 50 mL. Effectuer toutes les étapes d’une ESB stérile.
2. Récupérer un flacon de cellules CD34+ expansées et congelées in vitro pour quatre à six petits à injecter. Décongeler rapidement à 55 °C, jusqu’à ce qu’une petite quantité de glace soit visible, et ajouter les cellules au milieu CB réchauffé (le flacon doit encore être froid au toucher.) Utiliser 1 mL de milieu pour rincer chaque flacon et faire tourner les cellules à 360 x g pendant 12 min à 4 °C.
  REMARQUE : La décongélation rapide à 55 °C s’est avérée améliorer la viabilité cellulaire (90 % à 95 %) que la décongélation à 37 °C.
3. Aspirer le milieu avec précaution. Remettez en suspension la (petite) pastille dans 2 mL de milieu CB, mélangez doucement et ajoutez ~30 μL de la suspension cellulaire à un seul puits dans une plaque de comptage. Diluer 1:1 dans du bleu de trypan, puis ajouter 10 μL à un hémocytomètre et compter et faire la moyenne des cellules de quatre quadrants.
4. Calculez le nombre total de cellules CD34+ en multipliant le nombre de cellules par 4 x 10⁴ , puis notez la viabilité. Essorage à 360 x g pendant 12 min à 4 °C.
5. Aspirer soigneusement le milieu et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS stérile par bébé n + 1 à injecter, ce qui donne 250 000 à 450 000 cellules CD34+ par souris. Placez le tube conique sur de la glace dans un conteneur de transport et dirigez-vous vers le vivarium pour l’injection de chiots.
6. Apportez une lampe chauffante, des couches, une seringue de 1 mL, une aiguille de 18 G, une aiguille de 30 G et la préparation de cellules CD34+ dans des contenants stériles au vivarium BSC. Placez une couche stérile ~ 2 pieds sous la lampe chauffante. Récupérez la cage avec la litière à injecter et placez-la dans l’ESB.
7. Assemblez la seringue à l’aide d’une aiguille biseautée de 18 G. En faisant correspondre l’angle du tube conique avec le biseau de l’aiguille, mélanger délicatement et aspirer la suspension cellulaire. Placez les chiots sur la couche pour les réchauffer (surveillez la surchauffe). Retirez l’air de la seringue et remplacez l’aiguille de 18 G par l’aiguille de 30 G, puis poussez soigneusement la seringue jusqu’à ce que la suspension cellulaire soit juste à l’extrémité de l’aiguille.
  REMARQUE: Alternativement, une seringue à insuline peut être utilisée.
8. Emmenez un chiot à la fois au bord de la couche, loin de la lampe chauffante. Immobilisez le chiot sur le côté sous le pouce et l’index, permettant une vue claire du visage. Remarquez la veine à travers la joue sous l’endroit où l’oreille sera. Insérez l’aiguille peu profondément dans la veine (IV) la plus proche de l’œil et injectez lentement 50 μL de cellules.
9. Vérifiez si une bulle se forme à partir d’une injection sous-cutanée. Si c’est le cas, insérez l’aiguille plus profondément et procédez à l’injection de cellules. Une petite goutte de sang / hématome sera visible en cas de succès.
  NOTE: Se référer à la procédure de Gombash Lampe et ^al.24 concernant l’injection de chiots.
10. Avec le chiot toujours immobilisé, effectuer une injection intrahépatique (IH) avec 50 μL supplémentaires de cellules (100 μL au total par chiot de IV + IH). Le foie peut être visualisé comme une tache sombre entre la bande de lait blanc et la cage thoracique. Placez le chiot injecté sur une couche plus éloignée des chiots non injectés et chauffez.
  REMARQUE: L’injection IV entraîne un meilleur chimérisme à long terme que l’injection d’HI seule²⁵, mais les injections IV ne sont pas toujours réussies. Par conséquent, la division de l’injection entre IV et IH assure la greffe dans un plus grand pourcentage de souris.
11. Répétez les injections de veines faciales et d’IH pour tous les chiots. Nettoyez tout sang, remettez les chiots au nid dans leur cage et couvrez-les de litière.

2. Tester le chimérisme humain dans le sang

Testez le chimérisme dans le sang de souris HIS à l’âge de 10 et 14 semaines. Prélever 50 μL de sang par la veine rétro-orbitaire ou en utilisant une autre méthode approuvée par l’IACUC.
1. Pour les saignements rétro-orbitaux, anesthésiez les souris avec un vaporisateur d’isoflurane réglé sur 5 pendant 1-2 minutes, puis réglez le réglage du vaporisateur sur 4. Baissez le vaporisateur au besoin pour permettre aux souris de rester suffisamment oxygénées sous anesthésie. Ne pas garder les souris sous isoflurane pendant plus de 5 minutes.
2. Placez le nez de la souris anesthésiée dans le cône nasal du vaporisateur d’isoflurane et placez une goutte de l’analgésique (solution ophtalmique de HCl à 0,5% de proparacaïne USP) sur l’œil.
3. Après 1 min, retirer la proparacaïne à l’aide d’une gaze stérile, proptose l’œil et insérer un tube hématocrite hépariné de 75 mm rétro-orbitalement pour recueillir 50 μL de sang. Éjecter le sang dans un tube à microfuge de 1,5 mL contenant 50 μL d’héparine et mélanger doucement.
4. Pincez l’œil fermé avec de la gaze stérile pour arrêter le saignement et appliquez une goutte de proparacaïne. Retirez la souris de l’isoflurane et récupérez dans une cage propre.
Isolement PBMC du sang de souris
1. Mélanger le sang/héparine en pipitant doucement de haut en bas et en superposant lentement sur 500 μL de gradient de densité de 1,077 g/mL, en prenant soin de ne pas perturber l’interface. Centrifuger les tubes à 1 220 x g pendant 20 min à TA sans freins.
2. Visualisez la couche leucocytaire cellulaire comme une couche trouble au-dessus du gradient de densité de 1,077 g/mL, sous le plasma. Retirer le plus grand nombre possible de cellules de la couche leucocytaire à l’aide d’une pipette de 200 μL et les ajouter à de nouveaux tubes de 1,5 mL contenant 750 μL de milieu de récolte. Centrifuger à 360 x g pendant 11 min à RT.
3. Aspirer le milieu jusqu’à 50 μL et remettre en suspension le granulé dans 750 μL de milieu de récolte. Centrifuger à 360 x g pendant 10 min à 4 °C, puis aspirer à nouveau jusqu’à 50 μL. Les cellules sont prêtes à être remises en suspension dans la tache de surface.
Coloration de surface et analyse cytométrique en flux
1. Remplissez la feuille de travail sur les panneaux de coloration (tableau 1; « panneau de purge spectrale » avec les numéros de souris et préparer le cocktail de coloration des anticorps en ajoutant tous les anticorps fluorescents au tampon de coloration (dossier supplémentaire 1). Faites une disposition de plaque pour ajouter les échantillons à une plaque de fond en U de 96 puits. Marquez le fond des puits à l’aide d’un marqueur permanent. Titrer les anticorps en utilisant une procédure standard avant la coloration afin de déterminer la concentration appropriée²⁶.
2. Ajouter 62 μL du cocktail de taches de surface à chaque puits de la plaque de fond en U de 96 puits. Remettez en suspension les cellules dans les 50 μL restant dans le tube et ajoutez chaque échantillon à son puits correspondant. Inclure un puits pour un contrôle positif de la coloration (PBMC humains + splénocytes de souris, 1 x 10⁶ cellules chacun) pour colorer à côté des échantillons. Mélanger par pipetage et incuber le mélange pendant 15 min à 4 °C.
3. Centrifuger à 680 x g pendant 3 min à 4 °C. Sortez la plaque dans l’évier pour retirer le surnageant et lavez les cellules en remettant en suspension 150 μL de tampon de coloration en pipetant doucement ~10x. Faire tourner et remettre en suspension chaque puits dans 150 μL de tampon de coloration.
4. Acquérir les données pour 100 μL de chaque échantillon sur un cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux) et exporter les fichiers .fcs. Importez les fichiers .fcs dans le logiciel d’édition des données de flux (voir Table des matières). Appliquez une porte polygonale sur une parcelle FSC-A x SSC-A entourant les cellules, à l’exclusion de tout débris. Sélectionnez les cellules à l’intérieur de la porte (voir le tableau 1; feuille de travail « Spectral Flow Bed Gating »).
5. Changez les axes en (FSC-A x FSC-H) et grillez les cellules contenues sur la diagonale linéaire à l’exclusion des doublets qui dépassent de la ligne. Sélectionnez ces cellules et remplacez les axes par (hCD45 x mCD45).
6. Appliquez une porte polygonale à la population hCD45+ et appliquez le nom « humain ». Appliquez une porte polygonale à la population mCD45+ et appliquez le nom « souris ». Créez une statistique de comptage pour les populations humaines et de souris.
7. Sélectionnez la population humaine et remplacez les axes par (CD19 x CD3). Appliquez une porte polygonale aux cellules CD19+ et nommez-la « cellules B ». Appliquez une porte polygonale à la population de CD3+ et nommez-la « lymphocytes T ». Appliquez une porte polygonale à la population doublement négative et nommez-la « NonTB ».
8. Sélectionnez la population de lymphocytes T et remplacez les axes par (CD8 x CD4). Appliquez une porte polygonale aux populations CD4 et CD8 positives et nommez-les respectivement « CD4+ » et « CD8+ ».
9. Sélectionnez la population non tuberculeuse et remplacez les axes par (CD56 x myéloïde). Appliquez une porte polygonale à la population totale de CD56 positifs, y compris les événements doublement positifs, et nommez-la « cellules NK ». Appliquez une porte polygonale à la population CD56 négative et myéloïde positive et nommez-la « myéloïde ».
10. Créez un tableau pour les statistiques de pourcentage et de dénombrement de toutes les populations et exportez-les vers un tableur (voir Tableau des matières). Calculer %hCD45 chimérisme = %hCD45/(%hCD45 + mCD45).
11. Exclure les souris HIS qui sont <20% hCD45+ (de mCD45 + hCD45) pour d’autres expériences.
  REMARQUE : Dans cette étude, les PBMC ont été préparés en utilisant une séparation par gradient de densité de 1,077 g/mL pour un appauvrissement plus propre des globules rouges. Cette procédure excluait les granulocytes humains et de souris de la couche PBMC. Alternativement, la lyse de RBC peut être utilisée.

3. Injection de tumeurs chez la souris

Avant l’injection de la tumeur, confirmez le nombre de lymphocytes T à partir des données de saignement de 14 semaines. Les tumeurs sont injectées pour être prêtes à être récoltées entre 20 et 26 semaines si les cellules T représentent >20% et entre 24 et 28 semaines si les cellules T représentent <20% de la population totale de cellules immunitaires. Ce moment d’injection garantit que les souris sont âgées de 20 à 28 semaines et ont un nombre suffisant de cellules T à la fin de l’étude.
Injection de xénogreffes dérivées de lignées cellulaires (CDX)
REMARQUE : La procédure est décrite à l’aide des cellules d’adénocarcinome du sein MDA-MB-231 (voir le tableau des matières) à titre d’exemple.
1. Décongeler une partie aliquote des cellules congelées, laver 1x en remettant en suspension dans 10 mL de DMEM additionné de 10 % de FBS, 1 % de PenStrep et 1 % d’acides aminés non essentiels, et centrifuger à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le milieu et remettre en suspension dans 10 mL de DMEM supplémenté de 10% de FBS, 1% PenStrep et 1% d’acides aminés non essentiels dans une fiole T25 et incuber à 37 °C avec 5% de CO₂.
  REMARQUE: Les lignées cellulaires sont authentifiées par PCR pour assurer le bon type de cellule. Les surnageants cellulaires sont testés pour les mycoplasmes via un test biochimique avant l’injection.
2. Passage et expansion des cellules pendant la phase de croissance exponentielle à environ 80% de confluence.
  1. Aspirer le milieu, rincer les cellules avec 5 à 10 mL de PBS stérile (pH 7,2) et incuber avec 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 1 à 5 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent de la fiole.
  2. Ajouter 5 mL du même DMEM et mélanger en pipetant de haut en bas. Passer la totalité des 6 mL de suspension cellulaire dans une nouvelle fiole T75 traitée par culture tissulaire (dilution 1:3) et ajouter 10 mL supplémentaires de DMEM.
  3. Passage des cellules tous les 2-3 jours à 80% de confluence à 1:3 placage dilutionnel dans DMEM pour dilater les cellules.
3. Récoltez les cellules avec 0,25% de trypsine-EDTA pendant la phase de croissance exponentielle en six passages et lavez avec du PBS. Mélanger le PBS et l’extrait de membrane basale (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 1:1 et ajouter aux cellules à une concentration finale de 5 x 10⁷ cellules/mL.
4. Anesthésier les souris avec de l’isoflurane comme décrit à l’étape 2.1.1. Injecter par voie sous-cutanée 100 μL (5 x 10⁶ cellules) de suspension de cellules tumorales dans chaque flanc à l’aide d’une aiguille de 23 G.
Effectuer l’injection de xénogreffes dérivées du patient (PDX) à l’aide de trocarts. La procédure d’injection et d’autres instructions de développement et de maintenance pour le modèle PDX sont disponibles dans la littérature²⁷.

4. Mesure de la croissance tumorale

Vérifiez la progression tumorale une fois par semaine après l’implantation en palpant le long du flanc pour la croissance tumorale. Une fois que les tumeurs sont palpables, anesthésiez les souris avec de l’isoflurane (comme décrit à l’étape 2.1.1) et rasez-les sur chaque flanc avec une tondeuse électrique, en prenant soin autour de la tumeur pour prévenir les ulcérations à mesure que la tumeur se développe.
REMARQUE: Les souris peuvent être rasées avant l’injection de la tumeur pour prévenir les blessures à la peau autour des tumeurs; Cependant, le taux de repousse des cheveux pourrait obstruer les mesures tumorales.
Mesurez la longueur et la largeur des tumeurs deux fois par semaine à l’aide d’étriers et enregistrez les mesures en mm. Rapportez les mesures tumorales en volume tumoral (mm³) en utilisant la formule . Veillez à ne pas laisser la charge tumorale dépasser 2 000^mm3 par tumeur unique ou un volume combiné de 3 000 mm³.
REMARQUE : Les lignes directrices pour l’utilisation des souris dans la recherche sur le cancer varient selon l’emplacement. Veuillez consulter les politiques de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement du chercheur.

5. Traitements médicamenteux

Répartir les souris HIS dans des groupes de traitement équivalents en fonction du chimérisme hCD45, du chimérisme hCD3 et du chimérisme hCD8. Une fois que les tumeurs atteignent 100 mm³ en moyenne, commencez les traitements médicamenteux.
NOTE: Le nombre de souris par groupe est basé sur le nombre de souris HIS générées à partir du CB. Un minimum de quatre souris par groupe est recommandé. L’appariement multigroupe non bipartite (par exemple, dans le logiciel R-vivo de Manille) est utile pour ce groupe²⁸.
Voie et fréquence des médicaments
1. Injecter des inhibiteurs anti--1 (nivolumab, pembrolizumab) par voie intrapéritonique (i.p.) à raison de 30 mg/kg 1x par semaine ou 20 mg/kg 2x par semaine pour les traitements uniques, ou 10-15 mg/kg 2x par semaine pour les traitements combinés.
2. Doser les thérapies combinées, telles que les thérapies ciblées, les chimiothérapies et l’irradiation, conformément à la conception expérimentale. Les thérapies ciblées et les chimiothérapies peuvent être administrées par gavage oral, injection intraveineuse ou nourriture.
  REMARQUE: Les doses peuvent être modifiées et optimisées en fonction des données publiées et du modèle tumoral. Les études posologiques sont souvent testées chez des receveurs immunodéficients avant les études sur les souris SIH.
Surveillez les souris au moins 3 fois par semaine pour détecter les changements de santé tels que la perte de poids, les excréments lâches, la posture voûtée, la mobilité réduite et la perte de fourrure. Certains symptômes peuvent être des signes de toxicité médicamenteuse ou de GVH, et la posologie du médicament peut devoir être réduite ou arrêtée. Euthanasier les souris au besoin conformément aux politiques de soin et d’utilisation des animaux.

6. Prélèvement de tissus et de tumeurs de souris à la fin de l’étude

Euthanasier les souris individuellement selon les directives institutionnelles et vétérinaires en utilisant du gaz CO 2 comprimé avec un débit de 2,75 L/min. Surveillez les souris maintenues dans le CO₂ pendant 1 minute après la mort, puis effectuez une luxation cervicale comme forme secondaire d’euthanasie.
Collecte de sang
1. Prélever du sang par ponction intracardiaque. Tenez la souris en position verticale et insérez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G directement dans le cœur à partir d’une ligne juste à gauche de la ligne médiane et au-dessous des côtes. Recueillir le sang dans une seringue idéalement en un long tirage et transférer dans un tube marqué de 1,5 mL.
  REMARQUE: Des insertions d’aiguilles supplémentaires peuvent être effectuées pour prélever du sang supplémentaire dans les coins de la cavité pulmonaire avec soin.
2. Laisser le sang à 4 °C pendant 1 h, puis centrifuger le sang dans une microcentrifugeuse pendant 6 min à 7 800 x g. Recueillir le liquide clair (sérum) au-dessus de l’interface sanguine dans un deuxième tube propre et étiqueté de 1,5 mL. Conservez le sérum à -20 °C pour l’analyse en aval, comme les titres de cytokines inflammatoires ou d’immunoglobulines humaines et souris.
Dissection tissulaire
1. Après l’injection et la croissance de cellules tumorales chez les souris et l’administration de traitements médicamenteux, récoltez les tissus. Placez les souris sur une planche de dissection en mousse, avec des épingles pour les maintenir en place, et les bras et les jambes étendus à des angles de 45°. Faites une incision au milieu du torse, en commençant près du bassin et en s’étendant jusqu’au menton, en essayant d’éviter de couper le péritoine (bien que ce ne soit pas essentiel). Tirez la peau vers le bord et maintenez-la en place avec des épingles.
2. Extraire les ganglions lymphatiques (LN) à l’aide de pinces fines dans l’ordre suivant : inguinale, axillaire, cervicale, mésentérique, hiatale.
  REMARQUE: Chez les souris SEH, les LN sont souvent très petits, ressemblant à un anlage, ou « enflammés » avec une apparence distincte contrairement à celle d’une souris de type sauvage. Par conséquent, des tissus ressemblant à des LN sont prélevés sur chaque site. Les LN périphériques apparaissent souvent comme des « boules » remplies de liquide, tandis que les LN mésentériques sont plus denses. Les LN mésentériques sont les plus évidents et les plus cohérents et sont observés comme un ou deux nœuds plus denses distincts, par opposition à une chaîne.
3. Placer les LN sur un côté des lames de verre dépoli dans 8 ml de milieu de récolte dans une boîte de Pétri. En tenant les lames à des angles perpendiculaires avec les bords givrés vers l’intérieur, appuyez doucement sur les tissus jusqu’à ce que le contenu cellulaire soit libéré.
4. Rincez les lames plusieurs fois en les séparant et en les rassemblant pour libérer le maximum de cellules. Rassemblez les cellules à l’aide d’une pipette en verre de 5 po et filtrez-les à travers une pipette de 9 po en coton dans un tube conique étiqueté de 15 mL.
5. Extraire la rate du côté supérieur gauche de l’abdomen à l’aide de deux paires de forceps ou de forceps et de ciseaux. Notez la taille de la rate comme estimation du volume de milieu de remise en suspension. Recueillir et filtrer la rate par digestion mécanique à l’aide de lames de verre dépoli, comme avec les LN.
  NOTE: Toute technique de préparation de tissus pour suspensions unicellulaires peut être utilisée.
6. Effectuer le comptage et la remise en suspension des cellules à partir d’échantillons de tissus comme décrit ci-dessous.
  1. Centrifuger les cellules lymphatiques à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Aspirer le liquide et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de récolte avec de la DNase.
  2. Retirer les érythrocytes des cellules de la rate en incubant avec 3 mL de tampon de lyse ACK à TA pendant 3 min, puis en ajoutant 10 mL de milieu de récolte/DNase. Centrifuger à nouveau les cellules de la rate, aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 à 10 mL de milieu de récolte/DNase, en fonction de la taille de la rate (p. ex. 1 mL pour les très petites rates et jusqu’à 10 mL pour les plus grosses rates).
  3. Ajouter une partie aliquote de 10 μL de suspension cellulaire à 90 μL de milieu et compter sur un hémocytomètre. Centrifuger les LN et les cellules de la rate, aspirer les surnageants et remettre les cellules en suspension dans le milieu de récolte à une concentration de 1 x 10⁸ cellules/mL, soit un minimum de 80 μL.
7. Extraire les tumeurs.
  1. Retirez la tumeur du flanc ouvert en tenant la tumeur avec une pince tout en coupant lentement les bords de la tumeur avec des ciseaux de dissection.
  2. Une fois la tumeur enlevée, pesez-la et retirez 1/4 pour le traitement de l’ARN et de l’immunohistochimie (IHC). Diviser la tumeur 1/4 en deux; placer la moitié (1/8 de la tumeur entière) dans un cryoflacon, congeler dans le liquide N₂, et conserver à -80 °C pour les études génomiques en aval.
  3. Placez l’autre 1/8 de la tumeur dans un tube d’échantillon marqué contenant 10% de formol. Le lendemain, rincer et remettre en suspension le tissu dans de l’éthanol à 70% jusqu’à une utilisation ultérieure. Placer les 3/4 restants de la tumeur dans un plat de 6 cm et hacher en morceaux de ~1 mm à l’aide d’une lame de scalpel.
  4. Transporter les morceaux tumoraux dans un tube de dissociation (voir le tableau des matériaux), rincer le plat avec 5 mL de milieu leucocytaire infiltrant la tumeur incomplète (TIL) et ajouter au tube de dissociation.
    REMARQUE: Pour les tumeurs pesant >0,4 g, rincer le plat avec 10 ml de milieu incomplet TIL et ajouter au tube de dissociation.
  5. Ajouter la préparation de collagénase (voir le tableau des matières) à une concentration finale de 50 mg/mL dans le tissu dans le tube de dissociation. Dissocier le tissu par dissociation mécanique à 37 °C pendant 30 min à 1 h, selon la fermeté de la tumeur.
  6. Après dissociation, passer la suspension sur un filtre de 100 μm dans un tube conique de 50 mL et rincer le filtre avec 10 mL de milieu complet TIL. Le sérum dans ce milieu arrêtera la réaction de collagénase et protégera les cellules contre une dégradation ultérieure.
  7. Centrifuger la suspension unicellulaire à 360 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez le granulé en suspension dans juste assez de milieu de récolte avec de la DNase pour que la suspension cellulaire puisse facilement passer à travers une pointe de pipette P1000 et enregistrer le volume pour l’analyse en aval.
    REMARQUE: Un volume plus petit augmente la collecte de cellules immunitaires tumorales mais est plus sensible aux obstructions du cytomètre en flux.

7. Coloration cellulaire et analyses cytométriques en flux

Préparation des taches et placage cellulaire
1. Préparez des cocktails de coloration : Le jour de la récolte, ajoutez le nombre d’échantillons à la feuille de travail de coloration (tableau 2; Feuilles de travail « Panneau Flux A conventionnel », « Panneau B à flux spectral » et « Panneau Flux C conventionnel ») pour toutes les taches et impressions. Préparer des cocktails de taches de surface pour les taches A et B dans un tampon de coloration (SB) en ajoutant chaque anticorps individuellement avec un nouvel embout, en marquant chaque réactif en déplacement, et conserver à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Préparer les colorants de viabilité appropriés dans du PBS sans azoture et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire (chaud à TA avant utilisation). Préparer le cocktail de la tache de surface C le jour 2 en SB avec les taches intracellulaires B et C dans leurs tampons de perméabilisation respectifs.
2. Créer une disposition de plaque pour tous les échantillons de la feuille de coloration et allouer 100 μL de PBS sans azoture aux puits. Inclure des témoins non colorés pour chaque tissu et coloration (pour la cytométrie spectrale).
3. Ajouter les cellules à des plaques de 96 puits contenant 50 μL de PBS. Pour la coloration A, remettre en suspension chaque groupe de tissu dans le volume approprié, comme indiqué sur la feuille de coloration, et conserver à 4 °C jusqu’à l’acquisition sur le cytomètre en flux le même jour. Pour les taches B et C, ajouter 25 μL de lymphe et 60 μL de suspensions de cellules tissulaires non lymphatiques aux puits avec PBS.
4. Effectuer une stimulation in vitro des cytokines pour la détection par coloration intracellulaire à l’aide de la coloration C.
  1. Centrifuger la plaque de coloration C 96 puits de l’étape 7.1.3 à 680 x g pendant 3 min à 4 °C. Ajouter 200 μL de milieu complet TIL (RPMI 1640, HEPES 10 mM [pH 7], 10% FBS) à chaque puits. Conserver la plaque avec la suspension cellulaire à 4 °C pendant la nuit.
  2. Tôt le lendemain matin, diluer le cocktail de stimulation cellulaire (voir le tableau des matériaux) 1:500 dans un milieu TIL complet. Centrifuger la plaque contenant la suspension cellulaire à 680 x g pour granuler les cellules et effleurer pour retirer le média. Resuspendre les cellules dans 200 μL du cocktail de stimulation cellulaire préparé et incuber à 37 °C pendant 1 h.
  3. Ajouter 25 μL de solution inhibitrice du transport des protéines contenant du monensin à une dilution de 1:1 000 dans un milieu TIL complet, mélanger les cellules et incuber à 37 °C pendant 4 heures supplémentaires pour permettre l’accumulation intracellulaire de cytokines.
5. Effectuer la coloration cellulaire.
  1. Pour les colorations A et B (Jour 1), et pour la coloration C (Jour 2), centrifuger à 680 x g pendant 3 min à 4 °C. Agitez les plaques et ajoutez les colorants de viabilité appropriés aux puits. Bien mélanger en pipotant doucement de haut en bas avec une pipette multicanal et d’incuber pendant 15 min à TA.
  2. Centrifuger les plaques (comme à l’étape 7.1.5.1), puis ajouter les taches de surface appropriées sur les plaques et mélanger délicatement en pipetant avec une pipette multicanaux. Incuber pendant 15 min à 4 °C et centrifuger à nouveau. Agiter les plaques, laver les cellules en pipitant doucement de haut en bas avec 150 μL de SB et centrifuger.
  3. Agiter les plaques, répéter le lavage en pipitant doucement de haut en bas avec 150 μL de SB et centrifuger à 680 x g pendant 3 min à 4 °C. Pour la coloration A, remettre en suspension chaque groupe de tissu dans le volume approprié, comme indiqué sur la feuille de coloration, et conserver à 4 °C. Pour la tache B, corriger avec le fixateur du kit de facteur de transcription FoxP3 (voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes à TA. Pour la coloration C, fixer dans 1% (v/v) de paraformaldéhyde dans SB pendant 30 min à TA.
  4. Centrifuger les plaques fixes à 480 x g pendant 3 min à 4 °C. Lavez 1x dans SB. Pour la tache B, les cellules peuvent être laissées pendant la nuit.
  5. Perméabiliser les cellules : remettre les puits en suspension dans 150 μL de tampon de perméabilisation du kit de facteur de transcription FoxP3 pour la coloration B et dans 0,5 % (p/v) de saponine dans SB pour la coloration C. Incuber pendant 15 min à TA. Centrifuger les plaques fixes à 480 x g pendant 3 min à 4 °C.
  6. Agitez les assiettes et ajoutez les cocktails de coloration intracellulaire respectifs pour la tache B et la tache C. Incuber pendant 30 min à TA.
  7. Centrifuger les plaques fixes à 480 x g pendant 3 min à 4 °C et agiter les plaques. Laver les cellules avec 150 μL des tampons de perméabilisation correspondants (tache B, tampon de perméabilisation du kit de facteur de transcription FoxP3; coloration C, saponine).
  8. Agiter les plaques et laver en pipetant de haut en bas dans 150 μL de SB. Centrifuger à 480 x g pendant 3 min à 4 °C. Agiter les plaques et remettre en suspension les cellules de SB par groupe de tissus dans les volumes appropriés indiqués sur la feuille de travail de coloration.
    REMARQUE: Les échantillons sont maintenant prêts pour l’acquisition par cytométrie spectrale.
  9. Installez le cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux) avec des témoins à coloration unique appropriés pour chaque coloration et des échantillons non colorés pour chaque groupe de tissus afin de tenir compte des différences d’autofluorescence pendant le démélange. Procurez-vous les volumes appropriés par groupe de tissus, tel que défini dans la feuille de calcul de coloration (Tableau 2) et exportez les fichiers .fcs.
Analyse des données de cytométrie en flux
1. À l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux (voir Tableau des matériaux), créez un nouvel espace de travail. Créez de nouveaux groupes pour chaque organe (LN, rate et TIL). Importez les fichiers .fcs de chaque organe dans le groupe.
2. Créez un diagramme à points bivarié, définissez les axes sur (FSC-A x SSC-A) et appliquez une porte polygonale aux événements cellulaires, en évitant les événements sur les bords (porte toutes les cellules). Sélectionnez les événements cellulaires, remplacez les axes par (FSC-A x FSC-H) et appliquez une porte polygonale aux événements de la diagonale linéaire, en excluant les événements qui s’écartent de la diagonale pour générer la porte « singlets ». Sélectionnez la porte « singlets » et changez les axes en (hCD45 x mCD45). Appliquez des portes polygonales aux événements positifs hCD45 et mCD45 et nommez-les respectivement « humain » et « souris ».
3. Sélectionnez la population humaine et changez l’axe des Y en Aqua vivante/morte. Appliquez une porte polygonale à la population positive hCD45 négative vivante/morte et nommez-la « humain vivant ». Sélectionnez la population de souris et changez l’axe X en Live/Dead Aqua. Appliquez une porte polygonale à la population positive mCD45 négative Live/Dead et nommez-la « souris vivante ».
4. De la même manière, sélectionnez la porte parente et les axes X et Y, comme indiqué dans les feuilles de travail « Point de contrôle du flux A conventionnel », « Grille du flux spectral B » et « Points de contrôle du flux C conventionnel » (tableau 2) pour isoler les populations indiquées (p. ex. cellules B humaines, cellules T activées).
  REMARQUE : Un point de contrôle représentatif pour chaque tache (Bleed, A, B, C) est inclus dans le dossier supplémentaire 2.
5. Créer des tableaux d’exportation de numération et de fréquence dans le logiciel d’analyse de cytométrie en flux pour toutes les populations et exporter vers un tableur. La population mère pour les fréquences est indiquée dans le tableau 2.
6. Utilisez les données pour générer des graphiques basés sur des groupes de traitement expérimentaux.
  REMARQUE: Les données peuvent également être analysées à l’aide de packages R dans le logiciel d’analyse. Un seul fichier .fcs de tous les échantillons à analyser peut être créé à l’aide de la fonction de concaténation. Ces données peuvent être réduites dimensionnellement avec l’algorithme T-SNE tout en ajoutant des paramètres de mots-clés pour le type de tissu et le groupe de traitement. L’algorithme FlowSOM peut ensuite être utilisé pour regrouper les populations et l’outil ClusterExplorer peut être utilisé pour identifier les populations. Les nouvelles populations cellulaires peuvent être identifiées de cette manière, comparées visuellement et quantifiées entre les groupes de traitement ou au sein de divers tissus.
7. Corréler les paramètres immunitaires pour les tumeurs au sein du même groupe de traitement, avec la croissance de cette tumeur pour définir les immunotypes qui sont en corrélation avec l’inhibition de la croissance tumorale. Quantifier la croissance tumorale par le taux de croissance spécifique (SGR) de cette tumeur, une mesure qui prend en compte la différence de volume tumoral sur une période donnée. Cette mesure normalise les tumeurs récoltées à des jours différents en raison de la santé de la souris et des dates de début du traitement.

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Representative Results

Conformément au protocole de tumeur du flanc et à la chronologie expérimentale (Figure 1), la croissance tumorale et la réponse immunitaire à un traitement ciblé par inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) et à un traitement combiné par nivolumab ont été étudiées dans deux PDX distincts de cancer colorectal humain (CCR). Les médicaments TKI ont été étudiés chez des hôtes immunodéficients pour évaluer la croissance tumorale seulement²⁹. Ce modèle a permis d’étudier les changements dans la réponse immunitaire de l’ITK seul, et plus important encore, en combinaison avec l’anti--1. Cette étude s’est concentrée sur les cohortes traitées en combinaison dans deux expériences distinctes qui représentent une évaluation réussie utilisant des souris HIS-BRGS et une expérience techniquement défectueuse. Pour PDX CRC307P, le traitement combiné a ralenti la croissance de la tumeur, déterminée par les volumes de croissance tumorale au fil du temps, le poids de la tumeur à la récolte et le SGR (Figure 2A-C). D’autre part, la croissance d’un PDX développé à partir d’une tumeur métastatique du même patient, PDX CRC307M, testé dans une cohorte différente de souris HIS-BRGS, a été moins affectée par le même traitement combiné chez les souris HIS-BRGS (Figure 2D).

Malgré l’affectation de souris HIS-BRGS à des groupes expérimentaux équivalents en fonction du chimérisme global des lymphocytes T humains (hCD45+) et humains (hCD3+) dans le sang avant l’implantation tumorale (Figure 3A-C), les deux paramètres ont augmenté dans le système immunitaire périphérique (rate) et les leucocytes infiltrant les tumeurs (TIL) chez les souris CRC307P traitées en association, mais pas dans le modèle CRC307M (Figure 3D-F ). Notamment, bien que les deux cohortes HIS-BRGS présentaient un chimérisme humain et lymphocytaire T comparable dans le sang avant l’implantation de la tumeur, la cohorte CRC307M présentait très peu de chimérisme ganglionnaire et n’a pas réussi à développer des niveaux appréciables de lymphocytes T dans la rate de la cohorte traitée (Figure 3D-F). L’expérience CRC307M représente un exemple techniquement défectueux en raison du chimérisme global insuffisant des lymphocytes T spléniques et du chimérisme des ganglions lymphatiques. Nous suggérons l’exclusion des souris HIS qui ont <20% de chimérisme hCD3+ dans la rate et / ou <1,5 x 10⁶ hCD45+ cellules dans les ganglions lymphatiques à la fin de l’étude. Pour le modèle CRC307M, la majorité des souris ont été exclues, principalement en raison de très petits ganglions lymphatiques, ne laissant que deux souris par cohorte.

Une étude plus approfondie des cellules T humaines (Figure 4A) a révélé plus de cellules T activées (HLA-DR +) dans les tumeurs CR307P, mais pas la lymphe, de souris traitées en combinaison (Figure 4B). Dans l’expérience CRC307M « négative », il n’y avait pas d’augmentation significative des lymphocytes T HLA-DR+ dans les TIL des souris HIS-BRGS traitées lors de l’analyse de toutes les souris, ce qui suggère que cette cohorte HIS-BRGS non optimale a influencé la signification des données en raison des souris HIS avec très peu de lymphocytes T et aucune activation (Figure 4B). En effet, l’augmentation des lymphocytes T HLA-DR+ dans les TIL du modèle CRC307M a atteint une signification significative en excluant le chimérisme des lymphocytes T faibles chez les souris HIS-BRGS (Figure 4B). De plus, il y avait plus de lymphocytes T CD8+ à mémoire effectrice et moins de lymphocytes T TIM-3+ (épuisés en phase terminale) dans les tumeurs CRC307P traitées en combinaison, alors que cette différence n’a pas été notée dans le modèle CRC307M (Figure 4C,D). Dans cette expérience, aucun changement dans la fréquence des populations de lymphocytes T cytotoxiques (Granzyme B+ ou IFNγ+TNFα+) n’a été observé chez les souris traitées en combinaison, bien que des lymphocytes T cytotoxiques plus élevés aient été observés dans les tumeurs non traitées (Figure 4E) ou traitées (données non présentées) par rapport aux ganglions lymphatiques. Fait important, bien qu’il n’y ait pas eu de différences de fréquences entre les populations de lymphocytes T, un nombre plus élevé de lymphocytes T cytotoxiques a été observé dans les tumeurs des souris HIS-CRC307P-BRGS traitées, avec des fréquences plus élevées (Figure 3B) et un nombre de cellules T humaines dans les tumeurs. D’autre part, ce traitement combiné n’a montré aucun effet sur les fréquences des Tregs dans les organes lymphatiques CRC307P ou les tumeurs, bien que les données CRC307M aient montré une tendance à la réduction des Tregs qui devrait être validée dans une autre expérience (Figure 4F).

En plus d’interroger le système immunitaire humain, les changements liés au système immunitaire sur les cellules tumorales ont également été évalués à l’aide de la cytométrie en flux (Figure 5A). En gating sur les cellules EpCAM+, comme décrit dans le protocole, une expression accrue du CMH de classe I (HLA-ABC) et de classe II (HLA-DR) a été observée sur les cellules tumorales CRC307P excisées de souris HIS-BRGS traitées en combinaison (Figure 5B). Dans le modèle CRC307M, ce même traitement médicamenteux induisait l’expression HLA de classe II sur les cellules tumorales, bien que dans une moindre mesure que dans le modèle CRC307P (Figure 5C). Ainsi, le traitement combiné semble induire une régulation positive du CMH de classe II, indépendamment de l’infiltration des lymphocytes T (Figure 5B,C). Notamment, l’expression du CMH sur les cellules tumorales était inférieure à celle sur les cellules immunitaires humaines, une constatation cohérente avec les rapports de tumeurs humaines (Figure 5B). De même, le traitement combiné a entraîné une augmentation de l’expression de-L1 sur les cellules tumorales EpCAM+ CRC307P (Figure 5D).

Enfin, les corrélations des réponses immunitaires avec la croissance tumorale ont été étudiées en traçant le SGR de la tumeur par rapport aux paramètres immunitaires. Bien que la fréquence des lymphocytes T CD4+ dans les tumeurs de souris non traitées n’ait montré aucune corrélation avec la croissance tumorale, l’augmentation des lymphocytes T CD4+ a montré une corrélation significative (Figure 6A) avec une croissance tumorale plus faible, et plus particulièrement les lymphocytes T activés par HLA-DR+ (Figure 6B), chez les souris HIS traitées en association.

Figure 1 : Schéma illustrant la génération de souris HIS-BRGS et l’implantation de tumeurs humaines CDX ou PDX pour les études d’immunothérapie du cancer. Le calendrier est important pour assurer la présence de cellules T qui mettent des mois à se greffer chez les souris HIS dérivées du CB. Créé avec Biorender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Analyse de la croissance tumorale. Mesures de croissance tumorale pour CRC307P PDX chez des souris témoins (noires) ou traitées en combinaison (rouge) HIS-BRGS quantifiées par (A) volume au fil du temps, (B) poids à la fin de l’étude, ou (C) taux de croissance spécifique (SGR). d) SGR pour CRC307M PDX. Les données incluent des tumeurs implantées dans les deux flancs de six souris HIS-BRGS véhicules, sept souris BRGS traitées en combinaison pour CRC307P et seulement deux souris véhicules et combinées traitées pour CRC307M en raison de taux d’exclusion élevés. Des analyses statistiques entre deux groupes indépendants ont été effectuées à l’aide du test t de Welch paramétrique non apparié à deux groupes. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Chimérisme immunitaire humain et lymphocytaire T dans les organes lymphatiques et les tumeurs de souris HIS-BRGS porteuses de tumeurs CRC PDX. (A) Analyse par cytométrie en flux représentative des cellules T hématopoïétiques humaines (hCD45) et de souris (mCD45) et humaines (CD3) dans le sang périphérique (PBMC) avant l’implantation de la tumeur, et dans les LN et les tumeurs (TIL) à la fin de l’étude. (B,C) Chimérisme humain et lymphocytaire T équivalent dans le sang à 14 semaines chez des souris HIS-BRGS ayant ensuite reçu des injections (B) de CRC307P ou (C) de PDX CRC307M et non traitées ou traitées par immunothérapie combinée (Tx). (D-F) Augmentation du nombre de lymphocytes T humains dans les organes lymphatiques et les tumeurs (TIL) des souris HIS-BRGS-CRC307P traitées en combinaison, mais pas des souris HIS-BRGS-CRC307M. Les données montrent les fréquences des lymphocytes T humains et T sur l’axe des Y en pourcentage de la population mère dans les tumeurs (D) des ganglions lymphatiques (LN), (E) des rates (SP) et (F) des souris individuelles à la fin de l’étude. Des analyses statistiques entre deux groupes indépendants ont été effectuées à l’aide du test t de Welch paramétrique non apparié à deux groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Analyse de l’activation des lymphocytes T par cytométrie de flux dans les organes lymphatiques périphériques et les tumeurs de souris CRC PDX portant le HIS-BRGS. (A) Analyse représentative par cytométrie en flux des lymphocytes T dans les LN, les rates (SP) et les tumeurs (TIL) excisées chez des souris HIS-BRGS mesurant les populations suivantes : lymphocytes T activés (HLA-DR+), lymphocytes T naïfs (CD45RA+ CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) et lymphocytes T cytotoxiques (Granzyme B+, TNFα+ et/ou IFNγ+). (B-D) Fréquences des populations de lymphocytes T indiquées dans les organes lymphatiques ou les TIL des souris HIS-CRC307P-BRGS et HIS-CRC307M-BRGS : (B) cellules T activées par HLA-DR+, (C) cellules T CD8+ CCR7-CD45RA-TEM, (D) cellules T CD8+ du récepteur inhibiteur TIM-3, (E) cellules T CD8+ Granzyme B et (F) Tregs CD25+FoxP3+. Pour les souris HIS-CRC307M-BRGS en (B), le premier ensemble de données montre toutes les souris analysées à la récolte, tandis que le deuxième ensemble de données ne comprend que celles qui ont suffisamment de chimérisme LN et lymphocytes T spléniques. Dans tous les graphiques, les symboles remplis pour 307M représentent des souris avec un chimérisme suffisant, tandis que les symboles ouverts sont exclus des souris SIH. Des analyses statistiques entre deux groupes indépendants ont été effectuées à l’aide du test t de Welch paramétrique non apparié à deux groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse par cytométrie en flux des classes I, II et-L1 du CMH sur des tumeurs humaines chez des souris HIS-BRGS. (A) Diagrammes de points représentatifs de cytométrie en flux, illustrant la stratégie de déclenchement pour mesurer les niveaux d’expression des CMH de classe I (HLA-ABC), de classe II (HLA-DR) et de-L1 sur les tumeurs épithéliales (EpCAM+) humaines chez les souris HIS-BRGS. (B-D) Intensité moyenne de fluorescence (MFI) de HLA-ABC (B), HLA-DR (B, C) et-L1 (D) sur des cellules humaines (hCD45+) et tumorales (EpCAM+) provenant de PDX dissociés CRC307P (B, D) ou CRC307M (C) excisés de souris HIS-BRGS. Des analyses statistiques entre deux groupes indépendants ont été effectuées à l’aide du test t de Welch paramétrique non apparié à deux groupes. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Abréviation : Tx = Traitement Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse des immunocorrélats de réponse. Les SGR de la croissance tumorale CRC307P dans les flancs de souris HIS-BRGS non traitées (Veh) ou traitées par immunothérapie combinée (Tx) ont été tracées par rapport à la fréquence des lymphocytes T (A) CD4+ ou (B) HLA-DR+ comme indicateur de paramètres immunitaires en corrélation avec une croissance tumorale réduite (c.-à-d. SGR plus petit). Une simple analyse de régression linéaire a été effectuée pour indiquer des corrélations significatives. Les valeurs de R² indiquent le degré de corrélation. *p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Feuille de travail sur les panneaux de coloration de surface. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Panneaux de coloration cellulaire et feuille de travail sur les points de contrôle de cytométrie en flux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Recettes pour les milieux et les solutions utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Contrôle représentatif de cytométrie en flux pour chaque coloration. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Au cours des 6 dernières années, en utilisant notre expertise en immunologie et en souris humanisées, notre équipe de recherche a développé un modèle préclinique indispensable pour tester des immunothérapies sur une variété de tumeurs humaines 3,7,30,31. Ce protocole met l’accent sur la prise en compte de la variabilité du modèle, avec une attention particulière aux populations de lymphocytes T humains centrés sur l’immunothérapie. Dans ce protocole, la génération de souris HIS est décrite, ainsi que l’analyse immunitaire de leurs organes lymphatiques et de la tumeur. Des protocoles de cytométrie en flux développés pour les cytomètres traditionnels basés sur la compensation et les cytomètres spectraux ont également été inclus. La capacité d’interroger les changements dans le système immunitaire dans de grands échantillons tumoraux, ainsi que dans la périphérie, représente un avantage significatif pour ce modèle préclinique. Un avantage supplémentaire de ce système est que plusieurs souris, hébergeant la même tumeur humaine unique, peuvent être réparties en cohortes distinctes et traitées avec différentes combinaisons de médicaments d’immunothérapie, effectuant essentiellement un « mini » essai de médicament. Combinés, ces deux facteurs permettent d’étudier les mécanismes d’action et de résistance des immunothérapies (combinées) proposées. Le modèle a la capacité de tester le calendrier et le dosage des médicaments sur une grande variété de tumeurs humaines et une multitude de traitements immunociblés, y compris les thérapies ciblées, les produits biologiques, les chimiothérapies, les radiations et même les thérapies cellulaires.

En raison de la variabilité inhérente au chimérisme des souris SIH, un nombre plus élevé de souris par groupe de traitement est nécessaire qu’un modèle de tumeur syngénique typique. En utilisant ces protocoles, des cohortes de cinq à sept souris HIS-BRGS par bras de traitement sont suffisantes pour obtenir des différences statistiques dans les paramètres immunitaires. Cette variabilité du chimérisme représente un défi dans ce modèle et doit être prise en compte. Un exemple expérimental démontrant à la fois la croissance tumorale et la réponse immunitaire lors d’un traitement combiné à un PDX CRC a été montré ici, ainsi qu’un exemple dans lequel le même traitement à un PDX CRC différent n’a pas montré une réponse forte similaire. Cette différence dans le résultat expérimental pourrait être due à la différence de PDX (même patient mais métastatique vs primaire) et / ou au chimérisme. Dans la deuxième expérience, il y avait très peu de lymphocytes T dans la rate de la majorité des souris du groupe de traitement, ainsi que de très petits LN; plusieurs laboratoires ont montré que la plus grande variabilité d’un lot à l’autre parmi les modèles HIS sont les fréquences des lymphocytes T 20,32,33. Nous avons également montré que la greffe humaine dans les LN est fortement corrélée avec le chimérisme des lymphocytes T³². Dans plus de 40 expériences, nous avons noté un besoin de 20% de lymphocytes T dans la rate pour un chimérisme adéquat pour détecter les changements immunitaires liés au traitement³. Après le sacrifice, il est important d’assurer une reconstitution significative des lymphocytes T, que nous définissons comme un développement notable de LN (>1,5 x 10⁶ cellules hCD45) et de >20% de lymphocytes T (de cellules hCD45+) dans la rate. Les souris HIS qui ne répondent pas à cette exigence sont retirées de l’ensemble de données. Le chimérisme dans le sang avant l’implant tumoral aide à prédire ce paramètre; cependant, il existe des différences dans le développement des lymphocytes T chez les souris individuelles au fil du temps qui sont mieux prises en compte à la fin de l’étude. Heureusement, dans ce modèle, environ 95% des cohortes de souris HIS-BRGS développent suffisamment de chimérisme des lymphocytes T pour les études d’immunothérapie. Il convient de souligner que l’analyse des données à la fin de l’étude devrait toujours inclure l’interrogation du chimérisme dans les organes lymphatiques périphériques et retirer les souris HIS qui ne répondent pas au chimérisme humain et aux lymphocytes T. Dans les expériences avec moins de quatre souris HIS par cohorte après cet ajustement, les résultats doivent être validés avec une cohorte HIS-BRGS différente dérivée d’un CB distinct.

Bien que notre groupe se soit concentré sur le modèle de souris BRGS destinataire, il existe de nombreux modèles disponibles dans le monde entier. Par exemple, le récepteur du NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ) est le modèle le plus largement caractérisé et est similaire au NOG (NOD.Cg-Prkdc ^scidIl2rg tm1Sug/Jic) et même au modèle NRG (NOD-Rag1 tm1Mom Il2rg ^tm1Wjl/SzJ), qui utilise les mutations Rag pour l’ablation génétique des cellules T et B de souris au lieu de la mutation SCID 20. Ces modèles sont tous sur la souche de fond NOD et ont donc l’allèle SIRPa^NOD, ce qui est important pour éviter la phagocytose des cellules humaines par les macrophages hôtes¹³. Les rapports suggèrent un chimérisme similaire dans ces modèles murins humanisés « de base » que dans le modèle BRGS, avec principalement des cellules B humaines au cours des premiers mois, suivies d’une greffe avec des cellules T humaines^32,34,35. Dans ces modèles, les cellules NK et myéloïdes sont sous-représentées par rapport à un^{humain 36,37}. Il existe plusieurs itérations de souris humanisées « nouvelle génération » qui peuvent améliorer le développement spécifique de la lignée grâce à l’introduction de cytokines spécifiques à l’homme. Par exemple, les souris NSG-SGM3 (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl Tg(CMV-IL3,CSF2,KITLG)1Eav/MloySzJ) ont des cytokines humaines IL-3, GM-CSF et SCF et une myélopoïèse humaine^{améliorée 37}, ou des transgènes HLA humains pour la sélection sur un HLA humain (par exemple, NSG-HLA-A2 ou BRGS-HLA-A2/DR2^38,39). Des critiques approfondies sur ce sujet^20,21 sont recommandées aux lecteurs. Les modèles murins HIS doivent être validés dans chaque laboratoire avec leur propre source de cellules souches humaines. Cette validation devrait inclure la quantification du chimérisme humain, y compris les cellules humaines B, T, NK et myéloïdes, dans le sang au fil du temps et dans les LN, la rate, la moelle osseuse et le thymus entre 16 et 20 semaines et à nouveau entre 24 et 28 semaines. Une attention particulière doit être accordée à la greffe multi-lignée, y compris le chimérisme des lymphocytes T. De plus, les taux de croissance des tumeurs doivent être testés chez les souris HIS par rapport aux souris non humanisées de la même souche. Il est plausible que des améliorations significatives dans les modèles murins HIS puissent entraîner le rejet de la tumeur. Dans le but d’économiser des ressources, ces courbes de croissance sont souvent effectuées simultanément avec les analyses des données de réponse immunitaire. Les souris HIS disponibles dans le commerce devraient inclure des données détaillées sur le chimérisme provenant du sang ainsi que des références au chimérisme dans d’autres organes d’autres cohortes.

Les protocoles expérimentaux d’analyse de la croissance tumorale et des réponses immunitaires chez les souris HIS aux CDX ou PDX humains nécessitent des méthodologies de laboratoire standard et une expertise immunologique. La génération de souris HIS, y compris l’isolement des cellules souches, l’injection à des souris immunodéficientes et le test du chimérisme humain dans le sang, sont toutes des procédures de laboratoire relativement simples. Les problèmes logistiques entourant cette procédure, y compris la sélection de souches de souris hautement immunodéficientes, l’acquisition d’une source fiable de CSH humaines, etc., sont l’élément le plus lourd du protocole. Sur le plan procédural, une plus grande attention doit être accordée à la conception expérimentale, y compris le moment de l’implantation de la tumeur (généralement 19 à 21 semaines lorsque suffisamment de lymphocytes T sont présents), le dosage du médicament et le calendrier de fin d’étude. L’acquisition de données de mesure tumorale est une autre procédure de routine. Cependant, étant donné que les données immunitaires sont souvent plus informatives que les données de croissance tumorale dans ce système, les analyses cytométriques en flux des réponses immunitaires peuvent fournir des données pertinentes. La coloration des cellules pour la cytométrie en flux est une autre procédure simple, tout comme l’apprentissage de l’utilisation d’un cytomètre en flux. Cependant, l’analyse et l’interprétation de ces données nécessitent une expertise unique. Bien que ce manuscrit serve d’épine dorsale pour mener des études immuno-oncologiques chez des souris SIH, chaque étape du protocole devrait être optimisée au sein d’un nouveau laboratoire. D’après l’expérience, le maintien de la santé des souris, l’acquisition de CSH adéquates à partir d’unités CB et le calendrier des injections tumorales pour suffisamment de cellules T nécessitent le plus d’attention et de dépannage.

Les souris HIS-BRGS présentent une immunosuppression extrême similaire à celle observée dans de nombreuses tumeurs humaines. Cette immunosuppression est notable, car des niveaux d’expression élevés de-1 et de TIGIT, mais moins de TIM-3, sont observés sur les cellules T dans les organes immunitaires périphériques des souris HIS-BRGS ^3,7. Ces lymphocytes T présentent également des marqueurs de l’activation immunitaire, notamment une expression élevée de HLA-DR et une faible expression de CCR7 et CD45RA, indiquant des lymphocytes T effecteurs, comme le montrent la figure 4 et les références ^3,7. Cette qualité est un paradoxe central du système; l’immunosuppression permet la croissance de tumeurs humaines allogéniques en présence d’un SIF allogénique, à des taux similaires voire plus rapides que les souris BRGS non humanisées ou nues (Nu/J) ^3,7,23. Cependant, il a été démontré que les stimuli immunitaires sont capables de surmonter cette immunosuppression et de rejeter une tumeur ^7,8. Bien que des changements significatifs dans la croissance tumorale entre les souris véhicules et traitées ne soient pas toujours observés, des différences significatives dans les phénotypes immunitaires ont été trouvées plus souvent, de sorte que l’analyse des taux de croissance tumorale corrélés aux phénotypes immunitaires est suggérée. Dans cette analyse, on a trouvé des paramètres immunitaires qui sont significativement corrélés avec une croissance tumorale réduite³. Ces données suggèrent que des « immunocorrélats » particuliers sont liés au traitement et participent au contrôle des tumeurs. Ainsi, les mesures de la croissance tumorale combinées aux phénotypes immunitaires dans le modèle murin HIS fournissent des données précliniques importantes en ce qui concerne les réponses immunitaires tumorales aux tumeurs humaines uniques. Le défi pour tout modèle préclinique est la corrélation avec les résultats cliniques. Le domaine de l’oncologie chez la souris HIS a plusieurs exemples de corrélation clinique: 1) nous et d’autres avons montré que l’infiltration immunitaire humaine est en corrélation avec le type tumoral 3,22,23,40; 2) nous avons montré un traitement efficace avec l’anti--1 dans un syndrome de Lynch ACC PDX prélevé sur un patient qui a ensuite répondu à ce traitement³¹ ; et 3) nous avons montré des réponses supérieures à un CCR MSS hi PDX, un cancer avec des taux de réponse élevés en clinique par rapport au CRC MSS PDX⁷ notoirement mal répondant. Avec des modèles in vitro et d’autres modèles in vivo, ces données fournissent un lien pour la traduction en clinique.

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Disclosures

Aucun.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier à la fois l’Animal Research Facility (OLAR) pour les soins qu’ils ont prodigués à nos souris et la ressource partagée en cytométrie en flux soutenue par la subvention de soutien au Centre de cancérologie (P30CA046934) de notre institut pour leur immense aide dans tout notre travail. Nous remercions également Gail Eckhardt et Anna Capasso pour nos collaborations inaugurales sur l’étude des immunothérapies aux PDX humains dans notre modèle HIS-BRGS. Cette étude a été financée en partie par la subvention de soutien du centre de cancérologie P30CA06934 des National Institutes of Health avec l’utilisation de la ressource partagée PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models), RRID: ressource partagée de cytométrie SCR_021990 et de flux, RRID: SCR_022035. Cette recherche a été financée en partie par le NIAID des National Institutes of Health sous le numéro de contrat 75N93020C00058.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe w/needles	McKesson	1031815
15 mL tubes	Grenier Bio-One	188271
2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
50 mL tubes	Grenier Bio-One	227261
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi	130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin	BD Bioscience	BDB563792
BSA	Fisher Scientific	BP1600100
Cell Stim Cocktail	Life Technologies	509305
Chill 15 Rack	Miltenyi	130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes	Fisher Scientific	13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract	R&D Systems	363200502
Cytek Aurora	Cytek
DNase	Sigma	9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set	Invitrogen	00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS	Gibco	10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume	Grenier Bio-One	616201
Excel	Microsoft
FBS	Benchmark	100-106 500mL
Ficoll Hypaque	GE Healthcare	45001752
FlowJo Software	BD Biosciences
Forceps - fine	Roboz Surgical	RS5045
Forceps normal	Dumont	RS4919
Formaldehyde	Fisher	F75P1GAL
Frosted Glass Slides	Corning	1255310
Gentlemacs C-Tubes	Miltenyi	130-096-334
GentleMACS Dissociator	Miltenyi	130-093-235
glass pipettes	DWK Life Sciences	63A53
Glutamax	Gibco	11140050
HBSS w/ Ca & Mg	Sigma	55037C
HEPES	Corning	MT25060CI
IgG standard	Sigma	I2511
IgM standard	Sigma	401108
IMDM	Gibco	12440053
Liberase DL	Roche	5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue	Thermo	L23105
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MEM	Gibco	1140050
mouse anti-human IgG-AP	Southern Biotech	JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled	Southern Biotech	H2
mouse anti-human IgM-AP	Southern Biotech	UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled	Southern Biotech	SA-DA4
MultiRad 350	Precision X-Ray
PBS	Corning	45000-446
Pen Strep	Gibco	15140122
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713A
p-nitrophenyl substrate	Thermo	34045
PRISM	Graphpad
Rec Hu FLT3L	R&D systems	308-FK-005/CF
Rec Hu IL6	R&D systems	206-IL-010/CF
Rec Hu SCF	R&D systems	255SC010
RPMI 1640	Corning	45000-39
Saponin	Sigma	8047-15-2
Scissors	McKesson	862945
Serological pipettes 25 mL	Fisher Scientific	1367811
Sterile filter	Nalgene	567-0020
Sterile molecular water	Sigma	7732-18-5
Yeti Cell Analyzer	Bio-Rad	12004279
Zombie Green	biolegend	423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis¹
Matthew S. Lewis¹
Hannah Strassburger¹
Stacey M. Bagby²
Adrian T. A. Dominguez²
Juan A. Marín-Jiménez³
Roberta Pelanda¹
Todd M. Pitts²
Julie Lang¹
¹Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
²Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
³Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis¹
Matthew S. Lewis¹
Hannah Strassburger¹
Kristina Larsen¹
Stacey M. Bagby²
Adrian T. A. Dominguez²
Juan A. Marín-Jiménez³
Roberta Pelanda¹
Todd M. Pitts²
Julie Lang¹
¹Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
²Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
³Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Cancer Research

Test d’immunothérapies anticancéreuses dans un modèle murin humanisé portant des tumeurs humaines

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Introduction

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Representative Results

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