JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

دراسة التفاعلات بين إنزيمات هيستون المعدلة وعوامل النسخ في الجسم الحي عن طريق نقل طاقة الرنين الفلوري

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) هو تقنية تصوير للكشف عن تفاعلات البروتين في الخلايا الحية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول FRET لدراسة ارتباط الإنزيمات المعدلة للهيستون بعوامل النسخ التي تجندها إلى المروجين المستهدفين للتنظيم اللاجيني للتعبير الجيني في الأنسجة النباتية.

Abstract

يتأثر التنظيم اللاجيني للتعبير الجيني عادة بإنزيمات تعديل الهستون (HMEs) التي تولد علامات هيستون غير متجانسة أو euchromatic لقمع النسخ أو التنشيط ، على التوالي. يتم تجنيد HMEs إلى الكروماتين المستهدف بواسطة عوامل النسخ (TFs). وبالتالي ، فإن اكتشاف وتوصيف التفاعلات المباشرة بين HMEs و TFs أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفتها وخصوصيتها بشكل أفضل. ستكون هذه الدراسات أكثر أهمية من الناحية البيولوجية إذا أجريت في الجسم الحي داخل الأنسجة الحية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لتصور التفاعلات في أوراق النبات بين هيستون ديوبيكوتيناز النبات وعامل نسخ النبات باستخدام نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، والذي يسمح باكتشاف المجمعات بين جزيئات البروتين التي تقع في حدود <10 نانومتر من بعضها البعض. يتم تقديم نوعين مختلفين من تقنية FRET: SE-FRET (الانبعاث الحساس) و AB-FRET (تبييض المستقبل) ، حيث يتم نقل الطاقة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل أو تنبعث إشعاعيا من قبل المتبرع عند التبييض الضوئي للمقبل. يمكن تكييف كل من نهج SE-FRET و AB-FRET بسهولة لاكتشاف التفاعلات الأخرى بين البروتينات الأخرى في النبات.

Introduction

تلعب deubiquitinases هيستون النبات دورا مهما في التحكم في التعبير الجيني عن طريق التعديل اللاحق للترجمة للهستونات ، وتحديدا عن طريق محو علامات monoubiquitylationالخاصة بها 1. حتى الآن ، يعد OTLD1 أحد نباتات هيستون ديوبيكوتيناز القليلة الوحيدة التي تتميز على المستوى الجزيئي في Arabidopsis 2,3. يزيل OTLD1 مجموعات monoubiquitin من جزيئات هيستون H2B ، وبالتالي تعزيز إزالة أو إضافة أستلة euchromatic وتعديلات المثيلة لهستونات H3 في الكروماتين الجيني المستهدف 4,5. علاوة على ذلك ، يتفاعل OTLD1 مع إنزيم آخر معدل للكروماتين ، وهو هيستون ليسين ديميثيلاز KDM1C ، للتأثير على قمع النسخ للجينات المستهدفة 6,7.

تفتقر معظم الإنزيمات المعدلة للهيستون إلى قدرات ربط الحمض النووي ، وبالتالي لا يمكنها التعرف على الجينات المستهدفة مباشرة. أحد الاحتمالات هو أنها تتعاون مع بروتينات عامل النسخ المرتبط بالحمض النووي الذي يربط هذه الإنزيمات ويوجهها إلى أهداف الكروماتين الخاصة بها. على وجه التحديد ، في النباتات ، من المعروف أن العديد من الإنزيمات الرئيسية المعدلة للهيستون (أي هيستون ميثيل ترانسفيراز8،9 ، هيستون أسيتيل ترانسفيراز 10 ، هيستون ديميثيلاز11 ، ومعقدات بوليكومب القمعية12،13،14) يتم تجنيدها بواسطة عوامل النسخ. تماشيا مع هذه الفكرة ، تم مؤخرا اقتراح آلية واحدة ممكنة لتوظيف OTLD1 للمروجين المستهدفين والتي تستند إلى تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين في OTLD1 مع عامل النسخ LSH1015.

ينتمي LSH10 إلى عائلة من بروتينات نبات ALOG (Arabidopsis LSH1 و Oryza G1) التي تعمل كمنظم تنموي مركزي16،17،18،19،20،21،22. حقيقة أن أعضاء عائلة بروتين ALOG تحتوي على زخارف ربط الحمض النووي 23 وتظهر القدرات على تنظيم النسخ22 ، والتوطين النووي19 ، و homodimerization24 تقدم مزيدا من الدعم لفكرة أن هذه البروتينات ، بما في ذلك LSH10 ، قد تعمل كعوامل نسخ محددة أثناء التنظيم اللاجيني للنسخ. إحدى التقنيات التجريبية الرئيسية المستخدمة لتوصيف تفاعل LSH10-OTLD1 في الجسم الحي هي نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET)15.

FRET هي تقنية تصوير للكشف المباشر عن التفاعلات القريبة المدى بين البروتينات داخل <10 نانومتر من بعضها البعض25 داخل الخلايا الحية. هناك نوعان رئيسيان من الاختلافات في نهج FRET26: الانبعاثات الحساسة (SE-FRET) (الشكل 1A) وتبييض المستقبل (AB-FRET) (الشكل 1B). في SE-FRET ، البروتينات المتفاعلة – أحدها موسوم بفلوروكروم مانح (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر ، GFP) والآخر مع فلوروكروم متقبل (على سبيل المثال ، بروتين فلوري أحمر أحادي ، mRFP27,28) – ينقل طاقة الحالة المثارة بشكل غير إشعاعي من المتبرع إلى المستقبل. نظرا لعدم انبعاث أي فوتونات أثناء هذا النقل ، يتم إنتاج إشارة فلورية لها طيف انبعاث إشعاعي مشابه للطيف المستقبل. في AB-FRET ، يتم الكشف عن تفاعلات البروتين وقياسها كميا بناء على الانبعاث الإشعاعي المرتفع للمتبرع عندما يتم تعطيل المستقبل بشكل دائم عن طريق التبييض الضوئي ، وبالتالي لا يمكنه تلقي الطاقة غير الإشعاعية المنقولة من المتبرع (الشكل 1). الأهم من ذلك ، أن الموقع تحت الخلوي لمضان FRET يدل على توطين البروتينات المتفاعلة في الخلية.

إن القدرة على نشر FRET في الأنسجة الحية وتحديد التوطين تحت الخلوي للبروتينات المتفاعلة في وقت واحد مع اكتشاف هذا التفاعل في حد ذاته ، يجعل FRET التقنية المفضلة للدراسات والتوصيف الأولي لتفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي. تعد منهجية التصوير الفلوري المماثلة في الجسم الحي ، تكملة التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) 29،30،31،32 ، نهجا بديلا جيدا ، على الرغم من أنه ، على عكس FRET ، قد ينتج BiFC إيجابيات خاطئة بسبب التجميع التلقائي لمراسلي BiFC الفلوري الذاتي 33 ، والقياس الكمي لبياناته أقل دقة.

تشارك هذه المقالة التجربة الناجحة في تنفيذ كل من تقنيات SE-FRET و AB-FRET وتقدم بروتوكولا لنشرها للتحقيق في التفاعلات بين OTLD1 و LSH10 في الخلايا النباتية.

Protocol

تم استخدام نيكوتيانا بينثاميانا أو سلالة Agrobacterium tumefaciens EHA105 أو GV3101 في هذه الدراسة. 1. بناء ناقلات الحنق حدد علامات الفلورسنت لزوج FRET المتبرع / المتقبل.استخدم EGFP من pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (انظر جدول المواد) لتوليد ?…

Representative Results

يوضح الشكل 2 النتائج النموذجية لتجربة SE-FRET ، حيث تم تسجيل نوى الخلية في وقت واحد في ثلاث قنوات (أي GFP المانحة ، و mRFP المتقبل ، و SE-FRET). تم استخدام هذه البيانات لإنشاء صور لكفاءة SE-FRET مشفرة في مقياس ألوان زائفة. على هذا المقياس ، يتوافق الانتقال من الأزرق إلى الأحمر مع زيادة في كف…

Discussion

بروتوكول FRET هذا بسيط وسهل التكاثر. كما يتطلب الحد الأدنى من الاستثمار في التوريد ويستخدم المعدات القياسية للعديد من المختبرات الحديثة. على وجه التحديد ، هناك خمس ميزات تقنية رئيسية تميز تنوع هذا الإجراء. أولا ، يتم إنشاء بنيات FRET باستخدام إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، وهو نهج استنساخ سهل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم العمل في مختبر V.C. بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (R35GM144059 و R01GM50224) و NSF (MCB1913165 و IOS1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Keywords: FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image