JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

Abstract

ויסות אפיגנטי של ביטוי גנים מושפע בדרך כלל מאנזימים משנים היסטון (HMEs) המייצרים סימני היסטון הטרוכרומטיים או אאוכרומטיים לדיכוי שעתוק או הפעלה, בהתאמה. HMEs מגויסים לכרומטין היעד שלהם על ידי גורמי שעתוק (TFs). לפיכך, זיהוי ואפיון אינטראקציות ישירות בין HMEs ו- TFs הם קריטיים להבנת תפקידם וספציפיותם טוב יותר. מחקרים אלה יהיו רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית אם יבוצעו in vivo בתוך רקמות חיות. כאן מתואר פרוטוקול להמחשת אינטראקציות בעלים של צמחים בין היסטון דאוביקוויטינאז צמחי לבין גורם שעתוק צמחי באמצעות העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET), המאפשרת זיהוי קומפלקסים בין מולקולות חלבון הנמצאות במרחק של <10 ננומטר זו מזו. מוצגות שתי וריאציות של טכניקת FRET: SE-FRET (פליטה רגישה) ו- AB-FRET (הלבנה מקבלת), שבהן האנרגיה מועברת באופן לא רדיאטיבי מהתורם למקבל או נפלטת באופן רדיאטיבי על ידי התורם עם הפוטו-הלבנה של המקבל. ניתן להתאים בקלות את שתי הגישות SE-FRET ו-AB-FRET כדי לגלות אינטראקציות אחרות בין חלבונים אחרים בפלנטה.

Introduction

היסטון דאוביקוויטינאזות צמחיות ממלאות תפקיד חשוב בשליטה על ביטוי גנים על ידי שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים, במיוחד על ידי מחיקת סימני המונוביקוויטילציהשלהם 1. עד כה, OTLD1 הוא אחד הצמחים הבודדים היסטון deubiquitinases המאופיינים ברמה המולקולרית ב Arabidopsis 2,3. OTLD1 מסיר קבוצות מונוביקוויטין ממולקולות היסטון H2B, ובכך מקדם הסרה או הוספה של אצטילציה אאוכרומטית ושינויי מתילציה של H3 היסטונים בגן המטרה כרומטין 4,5. יתר על כן, OTLD1 מקיים אינטראקציה עם אנזים משנה כרומטין אחר, היסטון ליזין דמתילאז KDM1C, כדי להשפיע על דיכוי שעתוק של גני המטרה 6,7.

רוב האנזימים המשנים היסטון חסרים יכולות קשירת DNA, ולכן אינם יכולים לזהות את גני המטרה שלהם באופן ישיר. אפשרות אחת היא שהם משתפים פעולה עם חלבוני פקטורי שעתוק קושרי דנ”א הקושרים את האנזימים האלה ומכוונים אותם למטרות הכרומטין שלהם. באופן ספציפי, בצמחים, מספר אנזימים עיקריים המשנים את ההיסטון (כלומר, היסטון מתיל-טרנספראזות8,9, היסטון אצטילטרנספראזות 10, היסטון דמתילאזות 11, וקומפלקסים מדכאים של פוליקומב12,13,14) ידועים כמגויסים על ידי גורמי שעתוק. בהתאם לרעיון זה, לאחרונה, הוצע מנגנון אפשרי אחד לגיוס OTLD1 למקדמי היעד המבוסס על אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות של OTLD1 עם גורם שעתוק LSH1015.

LSH10 שייך למשפחה של חלבוני ALOG צמחיים (Arabidopsis LSH1 ו-Oryza G1) המתפקדים כמווסתי התפתחות מרכזיים 16,17,18,19,20,21,22. העובדה שחברי משפחת חלבוני ALOG מכילים מוטיבים קושרי דנ”א 23 ומציגים את היכולות של תקנת שעתוק22, לוקליזציה גרעינית19 והומודימריזציה24 תומכת עוד יותר ברעיון שחלבונים אלה, כולל LSH10, עשויים לפעול כגורמי שעתוק ספציפיים במהלך ויסות אפיגנטי של שעתוק. אחת הטכניקות הניסוייות העיקריות המשמשות לאפיון אינטראקציית LSH10-OTLD1 in vivo היא העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET)15.

FRET היא טכניקת הדמיה לגילוי ישיר של אינטראקציות קרובות טווח בין חלבונים בטווח של <10 ננומטר זה מזה25 בתוך תאים חיים. ישנן שתי וריאציות עיקריות של גישת FRET26: פליטה רגישה (SE-FRET) (איור 1A) והלבנה מקבלת (AB-FRET) (איור 1B). ב-SE-FRET, החלבונים המקיימים אינטראקציה – אחד מהם מתויג עם פלואורוכרום תורם (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) והשני עם פלואורוכרום מקבל (למשל, חלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי, mRFP27,28) – מעבירים באופן לא רדיאטיבי את אנרגיית המצב הנרגש מהתורם למקבל. מאחר שלא נפלטים פוטונים במהלך העברה זו, נוצר אות פלואורסצנטי בעל ספקטרום פליטה רדיאטיבי הדומה לזה של המקבל. ב-AB-FRET, אינטראקציות חלבונים מזוהות ומכומתות על סמך פליטה רדיאטיבית מוגברת של התורם כאשר המקבל מושתק לצמיתות על ידי פוטו-הלבנה, ולכן אינו מסוגל לקבל את האנרגיה הלא-רדיאטיבית המועברת מהתורם (איור 1). חשוב לציין שהמיקום התת-תאי של פלואורסצנציה FRET מעיד על לוקליזציה של החלבונים המקיימים אינטראקציה בתא.

היכולת לפרוס FRET ברקמות חיות ולקבוע את הלוקליזציה התת-תאית של החלבונים המקיימים אינטראקציה בו זמנית עם גילוי אינטראקציה זו כשלעצמה, הופכת את FRET לטכניקה המועדפת למחקרים ולאפיון ראשוני של אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo. מתודולוגיית הדמיה פלואורסצנטית דומה in vivo, השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC)29,30,31,32, היא גישה חלופית טובה, אם כי, בניגוד ל- FRET, BiFC עשויה לייצר תוצאות חיוביות כוזבות עקב הרכבה ספונטנית של כתבי BiFCהאוטומטיים 33, וכימות הנתונים שלה פחות מדויק.

מאמר זה משתף את הניסיון המוצלח ביישום טכניקות SE-FRET ו- AB-FRET ומציג פרוטוקול לפריסתן כדי לחקור את האינטראקציות בין OTLD1 ו- LSH10 בתאי צמחים.

Protocol

ניקוטיאנה בנתמיאנה, זן אגרובקטריום טומפצ’ינס EHA105, או GV3101 שימשו למחקר הנוכחי. 1. בניית וקטור FRET בחר תגי פלואורסצנט עבור זוג FRET התורם/מקבל.השתמש ב-EGFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את וקטור התור…

Representative Results

איור 2 ממחיש את התוצאות האופייניות של ניסוי SE-FRET, שבו גרעיני התא תועדו בו-זמנית בשלושה ערוצים (כלומר, תורם GFP, mRFP מקבל ו-SE-FRET). נתונים אלה שימשו ליצירת תמונות של יעילות SE-FRET המקודדות בסולם צבעים מדומה. בסולם זה, המעבר מכחול לאדום מתאים לעלייה ביעילות FRET, מדד של קרבה חלבון-חלבון מ…

Discussion

פרוטוקול FRET זה פשוט וקל לשחזור; זה גם דורש השקעת אספקה מינימלית ומנצל ציוד סטנדרטי עבור מעבדות מודרניות רבות. באופן ספציפי, חמש תכונות טכניות עיקריות מבדילות את הרבגוניות של הליך זה. ראשית, מבני FRET נוצרים באמצעות רקומבינציה ספציפית לאתר, גישת שיבוט קלה לשימוש, מפיקה תוצאות מדויקות וחוסכת ז…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה במעבדה של V.C. נתמכת על ידי מענקים מ- NIH (R35GM144059 ו- R01GM50224), NSF (MCB1913165 ו- IOS1758046) ו- BARD (IS-5276-20) ל- V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Keywords: FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image