JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Abstract

Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu, transkripsiyonel baskı veya aktivasyon için sırasıyla heterokromatik veya ekromatik histon işaretleri üreten histon modifiye edici enzimlerden (HME’ler) sıklıkla etkilenir. HME’ler, transkripsiyon faktörleri (TF’ler) tarafından hedef kromatinlerine alınır. Bu nedenle, HME’ler ve TF’ler arasındaki doğrudan etkileşimleri tespit etmek ve karakterize etmek, işlevlerini ve özgüllüklerini daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalar, canlı dokular içinde in vivo olarak gerçekleştirilirse biyolojik olarak daha alakalı olacaktır. Burada, bir bitki histon deubikitinaz ile bir bitki transkripsiyon faktörü arasındaki etkileşimleri, birbirinden <10 nm uzaklıktaki protein molekülleri arasındaki komplekslerin tespit edilmesini sağlayan floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. FRET tekniğinin iki varyasyonu sunulmaktadır: SE-FRET (duyarlılaştırılmış emisyon) ve AB-FRET (alıcı ağartma), burada enerji donörden alıcıya radyal olmayan bir şekilde aktarılır veya alıcının fotobeyazlatılması üzerine donör tarafından ışınımsal olarak yayılır. Hem SE-FRET hem de AB-FRET yaklaşımları, muzdaki diğer proteinler arasındaki diğer etkileşimleri keşfetmek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

Bitki histon deubikitinazları, histonların post-translasyonel modifikasyonuyla, özellikle monoubikitilasyon işaretlerini silerek gen ekspresyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar1. Şimdiye kadar, OTLD1, Arabidopsis 2,3’te moleküler düzeyde karakterize edilen birkaç bitki histon deubikitinazından biridir. OTLD1, monoubikitin gruplarını H2B histon moleküllerinden uzaklaştırır, böylece hedef gen kromatin 4,5’teki H3 histonlarının ekromatik asetilasyon ve metilasyon modifikasyonlarının çıkarılmasını veya eklenmesini teşvik eder. Ayrıca, OTLD1, hedef genlerin transkripsiyonel baskılanmasını etkilemek için başka bir kromatin modifiye edici enzim olan histon lizin demetilaz KDM1C ile etkileşime girer 6,7.

Çoğu histon modifiye edici enzim DNA bağlanma yeteneklerinden yoksundur ve bu nedenle hedef genlerini doğrudan tanıyamazlar. Bir olasılık, bu enzimleri bağlayan ve onları kromatin hedeflerine yönlendiren DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörü proteinleriyle işbirliği yapmalarıdır. Spesifik olarak, bitkilerde, birkaç ana histon modifiye edici enzimin (yani, histon metiltransferazlar8,9, histon asetiltransferazlar 10, histon demetilatazlar 11 ve Polycomb baskılayıcı kompleksleri12,13,14) transkripsiyon faktörleri tarafından işe alındığı bilinmektedir. Bu fikirle tutarlı olarak, son zamanlarda, OTLD1’in hedef promotörlere işe alınması için OTLD1’in bir transkripsiyon faktörü LSH1015 ile spesifik protein-protein etkileşimlerine dayanan olası bir mekanizma önerilmiştir.

LSH10, merkezi gelişimsel düzenleyiciler 16,17,18,19,20,21,22 olarak işlev gören bitki ALOG (Arabidopsis LSH1 ve Oryza G1) proteinlerinin bir ailesine aittir. ALOG protein ailesinin üyelerinin DNA bağlayıcı motifler23 içermesi ve transkripsiyonel düzenleme22, nükleer lokalizasyon 19 ve homodimerizasyon24 kapasitelerini sergilemesi,LSH10 da dahil olmak üzere bu proteinlerin transkripsiyonun epigenetik düzenlenmesi sırasında spesifik transkripsiyon faktörleri olarak hareket edebileceği fikrine daha fazla destek vermektedir. LSH10-OTLD1 etkileşimini in vivo olarak karakterize etmek için kullanılan ana deneysel tekniklerden biri floresan rezonans enerji transferidir (FRET)15.

FRET, canlı hücrelerin içinde birbirlerinden25 <10 nm içindeki proteinler arasındaki yakın mesafeli etkileşimleri doğrudan tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. FRET yaklaşım26’nın iki ana varyasyonu vardır: duyarlılaştırılmış emisyon (SE-FRET) (Şekil 1A) ve alıcı beyazlatma (AB-FRET) (Şekil 1B). SE-FRET’te, biri donör florokrom (örneğin, yeşil floresan proteini, GFP) ve diğeri alıcı florokrom (örneğin, monomerik kırmızı floresan protein, mRFP27,28) ile etiketlenmiş olan etkileşimli proteinler, uyarılmış durum enerjisini radyal olmayan bir şekilde donörden alıcıya aktarır. Bu aktarım sırasında hiçbir foton yayılmadığından, alıcınınkine benzer bir ışınımsal emisyon spektrumuna sahip bir floresan sinyali üretilir. AB-FRET’te, protein etkileşimleri, alıcı fotobeyazlatma ile kalıcı olarak inaktive edildiğinde ve bu nedenle donörden aktarılan ışınımsal olmayan enerjiyi alamadığında donörün yüksek radyasyon emisyonuna dayanarak tespit edilir ve ölçülür (Şekil 1). Önemli olarak, FRET floresansının hücre altı konumu, hücredeki etkileşimli proteinlerin lokalizasyonunun göstergesidir.

FRET’yi canlı dokulara yerleştirme ve etkileşen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirleme yeteneği, bu etkileşimi kendi başına tespit etmekle aynı anda FRET’yi çalışmalar ve protein-protein etkileşimlerinin in vivo olarak ilk karakterizasyonu için tercih edilen teknik haline getirmektedir. Karşılaştırılabilir bir in vivo floresan görüntüleme metodolojisi olan bimoleküler floresan tamamlama (BiFC)29,30,31,32, iyi bir alternatif yaklaşımdır, ancak FRET’in aksine, BiFC, otofloresan BiFC muhabirlerinin spontan montajı nedeniyle yanlış pozitifler üretebilir 33 ve verilerinin nicelleştirilmesi daha az hassastır.

Bu makale, hem SE-FRET hem de AB-FRET tekniklerinin uygulanmasındaki başarılı deneyimi paylaşmakta ve bitki hücrelerinde OTLD1 ve LSH10 arasındaki etkileşimleri araştırmak için konuşlandırılmaları için bir protokol sunmaktadır.

Protocol

Bu çalışmada Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105 veya GV3101 kullanılmıştır. 1. FRET vektör yapısı Donör/alıcı FRET çifti için floresan etiketleri seçin.Donör vektörünü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 15,28’den EGFP kullanın (bkz. Alıcı vektörü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-m…

Representative Results

Şekil 2 , hücre çekirdeğinin aynı anda üç kanala (yani, donör GFP, alıcı mRFP ve SE-FRET) kaydedildiği bir SE-FRET deneyinin tipik sonuçlarını göstermektedir. Bu veriler, sahte renk ölçeğinde kodlanmış SE-FRET verimliliğinin görüntülerini oluşturmak için kullanıldı. Bu ölçekte, maviden kırmızıya geçiş, FRET verimliliğinde bir artışa, protein-protein yakınlığının% 0 ila% 100 arasında bir ölçüsüne karşılık gelir. Bu temsili deneyde, SE-FRET si…

Discussion

Bu FRET protokolü basit ve yeniden üretilmesi kolaydır; aynı zamanda minimum tedarik yatırımı gerektirir ve birçok modern laboratuvar için standart ekipman kullanır. Spesifik olarak, beş ana teknik özellik bu prosedürün çok yönlülüğünü ayırt eder. İlk olarak, FRET yapıları, kullanımı kolay, doğru sonuçlar üreten ve geleneksel kısıtlama enzimi tabanlı klonlamaya kıyasla zamandan tasarruf sağlayan bir klonlama yaklaşımı olan bölgeye özgü rekombinasyon kullanılarak oluşturulur. İk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

V.C.’nin laboratuvarındaki çalışmalar, NIH (R35GM144059 ve R01GM50224), NSF (MCB1913165 ve IOS1758046) ve BARD’dan (IS-5276-20) V.C.’ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S., Hartley, D. A. . Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. , 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Keywords: FRETProtein-protein InteractionAgroinfiltrationNicotiana BenthamianaHistone Modifying EnzymesTranscription FactorsLiving CellFluorescence Resonance Energy Transfer
check_url/64656?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image