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Biology

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Published: October 14, 2022
doi:
10.3791/64656
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York

Summary

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Abstract

La regulación epigenética de la expresión génica se ve comúnmente afectada por enzimas modificadoras de histonas (HME) que generan marcas de histonas heterocromáticas o eucromáticas para la represión o activación transcripcional, respectivamente. Los HME son reclutados a su cromatina diana por factores de transcripción (TF). Por lo tanto, detectar y caracterizar las interacciones directas entre HME y TF es fundamental para comprender mejor su función y especificidad. Estos estudios serían biológicamente más relevantes si se realizaran in vivo dentro de tejidos vivos. Aquí, se describe un protocolo para visualizar las interacciones en las hojas de las plantas entre una histona desubiquitinasa de la planta y un factor de transcripción de la planta utilizando la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), que permite la detección de complejos entre moléculas de proteínas que están dentro de <10 nm entre sí. Se presentan dos variaciones de la técnica FRET: SE-FRET (emisión sensibilizada) y AB-FRET (blanqueamiento aceptor), en el que la energía se transfiere de forma no radiativa del donante al aceptor o emitida radiativamente por el donante tras el fotoblanqueo del aceptor. Tanto los enfoques SE-FRET como AB-FRET se pueden adaptar fácilmente para descubrir otras interacciones entre otras proteínas en planta.

Introduction

Las histonas deubiquitinasas de plantas juegan un papel importante en el control de la expresión génica mediante la modificación postraduccional de histonas, específicamente borrando sus marcas de monoubiquitilación1. Hasta ahora, OTLD1 es una de las pocas histonas deubiquitinasas vegetales caracterizadas a nivel molecular en Arabidopsis 2,3. OTLD1 elimina los grupos monoubiquitina de las moléculas de histonas H2B, promoviendo así la eliminación o adición de acetilación eucromática y modificaciones de metilación de histonas H3 en el gen dianacromatina 4,5. Además, OTLD1 interactúa con otra enzima modificadora de la cromatina, la histona lisina desmetilasa KDM1C, para afectar la supresión transcripcional de los genes diana 6,7.

La mayoría de las enzimas modificadoras de histonas carecen de capacidades de unión al ADN y, por lo tanto, no pueden reconocer directamente sus genes diana. Una posibilidad es que cooperen con las proteínas del factor de transcripción de unión al ADN que se unen a estas enzimas y las dirigen a sus objetivos de cromatina. Específicamente, en las plantas, se sabe que varias enzimas modificadoras de histonas importantes (es decir, histona metiltransferasas8,9, histona acetiltransferasas 10, histona desmetilasas 11 y complejos represivos Polycomb12,13,14) son reclutadas por factores de transcripción. De acuerdo con esta idea, recientemente, se propuso un posible mecanismo para el reclutamiento de OTLD1 a los promotores objetivo que se basa en interacciones proteína-proteína específicas de OTLD1 con un factor de transcripción LSH1015.

LSH10 pertenece a una familia de las proteínas vegetales ALOG (Arabidopsis LSH1 y Oryza G1) que funcionan como reguladores centrales del desarrollo 16,17,18,19,20,21,22. El hecho de que los miembros de la familia de proteínas ALOG contengan motivos de unión al ADN23 y exhiban las capacidades para la regulación transcripcional 22, la localización nuclear19 y la homodimerización24 respalda aún más la idea de que estas proteínas, incluida LSH10, pueden actuar como factores de transcripción específicos durante la regulación epigenética de la transcripción. Una de las principales técnicas experimentales utilizadas para caracterizar la interacción LSH10-OTLD1 in vivo es la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)15.

FRET es una técnica de imagen para detectar directamente interacciones de corto alcance entre proteínas dentro de <10 nm entre sí25 dentro de células vivas. Hay dos variaciones principales del enfoque FRET26: emisión sensibilizada (SE-FRET) (Figura 1A) y blanqueo aceptor (AB-FRET) (Figura 1B). En SE-FRET, las proteínas que interactúan, una de las cuales se marca con un fluorocromo donante (por ejemplo, proteína fluorescente verde, GFP) y la otra con un fluorocromo aceptor (por ejemplo, proteína fluorescente roja monomérica, mRFP27,28), transfieren no radiativamente la energía del estado excitado del donante al aceptor. Debido a que no se emiten fotones durante esta transferencia, se produce una señal fluorescente que tiene un espectro de emisión radiativo similar al del aceptor. En AB-FRET, las interacciones proteicas se detectan y cuantifican en función de la emisión radiativa elevada del donante cuando el aceptor se inactiva permanentemente por fotoblanqueo y, por lo tanto, no puede recibir la energía no radiativa transferida del donante (Figura 1). Es importante destacar que la ubicación subcelular de la fluorescencia FRET es indicativa de la localización de las proteínas que interactúan en la célula.

La capacidad de desplegar FRET en tejidos vivos y determinar la localización subcelular de las proteínas que interactúan simultáneamente con la detección de esta interacción per se, hace de FRET la técnica de elección para estudios y caracterización inicial de interacciones proteína-proteína in vivo. Una metodología comparable de imagen de fluorescencia in vivo, la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC)29,30,31,32, es un buen enfoque alternativo, aunque, a diferencia de FRET, BiFC puede producir falsos positivos debido al ensamblaje espontáneo de los reporteros de BiFC autofluorescentes 33, y la cuantificación de sus datos es menos precisa.

Este artículo comparte la experiencia exitosa en la implementación de técnicas SE-FRET y AB-FRET y presenta un protocolo para su implementación para investigar las interacciones entre OTLD1 y LSH10 en células vegetales.

Protocol

Para el presente estudio se utilizaron Nicotiana benthamiana, cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens o GV3101. 1. Construcción de vectores FRET Seleccione etiquetas fluorescentes para el par FRET donante/aceptor.Utilice EGFP de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ver Tabla de materiales) para generar el vector donante. Utilice mRFP de pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 …

Representative Results

La Figura 2 ilustra los resultados típicos de un experimento SE-FRET, en el que los núcleos celulares se registraron simultáneamente en tres canales (es decir, GFP donante, mRFP aceptor y SE-FRET). Estos datos se utilizaron para generar imágenes de eficiencia SE-FRET codificadas en una escala de pseudocolor. En esta escala, la transición de azul a rojo corresponde a un aumento en la eficiencia FRET, una medida de proximidad proteína-proteína de 0% a 100%. En este experimento represent…

Discussion

Este protocolo FRET es simple y fácil de reproducir; También requiere una inversión mínima en suministro y utiliza equipos estándar para muchos laboratorios modernos. Específicamente, cinco características técnicas principales distinguen la versatilidad de este procedimiento. En primer lugar, las construcciones FRET se generan utilizando la recombinación específica del sitio, un enfoque de clonación que es fácil de usar, produce resultados precisos y ahorra tiempo en comparación con la clonación tradicional…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por subvenciones de NIH (R35GM144059 y R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) y BARD (IS-5276-20) a V.C.

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).
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