Undersøke interaksjoner mellom histonmodifiserende enzymer og transkripsjonsfaktorer in vivo ved fluorescensresonansenergioverføring

Summary

Fluorescens resonans energioverføring (FRET) er en avbildningsteknikk for å oppdage proteininteraksjoner i levende celler. Her presenteres en FRET-protokoll for å studere assosiasjonen av histonmodifiserende enzymer med transkripsjonsfaktorer som rekrutterer dem til målpromotorene for epigenetisk regulering av genuttrykk i plantevev.

Abstract

Epigenetisk regulering av genuttrykk påvirkes ofte av histonmodifiserende enzymer (HME) som genererer heterokromatiske eller eukromatiske histonmerker for henholdsvis transkripsjonell undertrykkelse eller aktivering. FVV rekrutteres til målkromatin ved transkripsjonsfaktorer (TFs). Å oppdage og karakterisere direkte interaksjoner mellom FVV og TF er derfor avgjørende for å forstå deres funksjon og spesifisitet bedre. Disse studiene vil være mer biologisk relevante hvis de utføres in vivo i levende vev. Her beskrives en protokoll for visualisering av interaksjoner i planteblader mellom en plantehiston deubiquitinase og en plantetranskripsjonsfaktor ved bruk av fluorescensresonansenergioverføring (FRET), som gjør det mulig å oppdage komplekser mellom proteinmolekyler som er innenfor <10 nm fra hverandre. To varianter av FRET-teknikken presenteres: SE-FRET (sensibilisert utslipp) og AB-FRET (akseptorbleking), der energien overføres ikke-radiativt fra giveren til akseptoren eller sendes ut radiativt av giveren ved fotobleking av akseptoren. Både SE-FRET og AB-FRET tilnærminger kan enkelt tilpasses for å oppdage andre interaksjoner mellom andre proteiner i planta.

Introduction

Plante histon deubiquitinases spiller en viktig rolle i å kontrollere genuttrykk ved post-translasjonell modifikasjon av histoner, spesielt ved å slette deres monoubiquitylation merker¹. Så langt er OTLD1 en av de få plante histon deubiquitinases karakterisert på molekylært nivå i Arabidopsis ^2,3. OTLD1 fjerner monoubiquitingrupper fra H2B-histonmolekylene, og fremmer dermed fjerning eller tilsetning av eukromatisk acetylering og metyleringsmodifikasjoner av H3-histoner i målgenkromatin ^4,5. Videre interagerer OTLD1 med et annet kromatinmodifiserende enzym, histonlysin-demetylase KDM1C, for å påvirke transkripsjonell undertrykkelse av målgenene ^6,7.

De fleste histonmodifiserende enzymer mangler DNA-bindingsevne, og kan dermed ikke gjenkjenne målgenene direkte. En mulighet er at de samarbeider med DNA-bindende transkripsjonsfaktorproteiner som binder disse enzymene og leder dem til kromatinmålene. Spesielt i planter er flere store histonmodifiserende enzymer (dvs. histonmetyltransferaser ^8,9, histon acetyltransferaser 10, histondemetylaser 11 og Polycomb repressive komplekser^12,13,14) kjent for å bli rekruttert av transkripsjonsfaktorer. I samsvar med denne ideen ble det nylig foreslått en mulig mekanisme for OTLD1-rekruttering til målpromotorene som er basert på spesifikke protein-protein-interaksjoner av OTLD1 med en transkripsjonsfaktor LSH10¹⁵.

LSH10 tilhører en familie av planten ALOG (Arabidopsis LSH1 og Oryza G1) proteiner som fungerer som sentrale utviklingsregulatorer 16,17,18,19,20,21,22. Det faktum at medlemmene av LOG-proteinfamilien inneholder DNA-bindende motiver 23 og viser kapasiteten til transkripsjonsregulering²², nukleær lokalisering¹⁹ og homodimerisering²⁴, gir ytterligere støtte til forestillingen om at disse proteinene, inkludert LSH10, kan fungere som spesifikke transkripsjonsfaktorer under epigenetisk regulering av transkripsjon. En av de viktigste eksperimentelle teknikkene som brukes til å karakterisere LSH10-OTLD1-interaksjonen in vivo er fluorescensresonansenergioverføring (FRET)¹⁵.

FRET er en avbildningsteknikk for direkte å oppdage nærgående interaksjoner mellom proteiner innen <10 nm fra hverandre²⁵ inne i levende celler. Det er to hovedvarianter av FRET-tilnærmingen²⁶: sensibilisert emisjon (SE-FRET) (figur 1A) og akseptorbleking (AB-FRET) (figur 1B). I SE-FRET er de samvirkende proteinene – hvorav den ene er merket med en donorfluorokrom (f.eks. grønt fluorescerende protein, GFP) og den andre med en akseptorfluorokrom (f.eks. monomert rødt fluorescerende protein, mRFP^27,28) – overfører ikke-radiativt den eksiterte tilstandsenergien fra giveren til akseptoren. Fordi ingen fotoner sendes ut under denne overføringen, produseres et fluorescerende signal som har et strålingsemisjonsspekter som ligner på akseptoren. I AB-FRET påvises og kvantifiseres proteininteraksjoner basert på forhøyet strålingsutslipp fra giveren når akseptoren inaktiveres permanent ved fotobleking, og dermed ikke er i stand til å motta den ikke-radiative energien overført fra giveren (figur 1). Det er viktig at den subcellulære plasseringen av FRET-fluorescensen indikerer lokaliseringen av de samvirkende proteinene i cellen.

Evnen til å distribuere FRET i levende vev og bestemme den subcellulære lokaliseringen av de samvirkende proteinene samtidig med å oppdage denne interaksjonen i seg selv, gjør FRET til den valgte teknikken for studier og innledende karakterisering av protein-protein-interaksjoner in vivo. En sammenlignbar in vivo fluorescensavbildningsmetodikk, bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC) 29,30,31,32, er en god alternativ tilnærming, selv om BiFC, i motsetning til FRET, kan produsere falske positiver på grunn av spontan montering av de autofluorescerende BiFC-reporterne ^33, og kvantifisering av dataene er mindre presis.

Denne artikkelen deler den vellykkede erfaringen med å implementere både SE-FRET og AB-FRET teknikker og presenterer en protokoll for distribusjon for å undersøke samspillet mellom OTLD1 og LSH10 i planteceller.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101 ble brukt til denne studien. 1. FRET vektor konstruksjon Velg fluorescerende koder for donor/akseptor FRET-paret.Bruk EGFP fra pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (se Materialtabell) for å generere donorvektoren. Bruk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (se Materialtabell) …

Representative Results

Figur 2 illustrerer de typiske resultatene av et SE-FRET-eksperiment, der cellekjernene samtidig ble registrert i tre kanaler (dvs. donor GFP, akseptor mRFP og SE-FRET). Disse dataene ble brukt til å generere bilder av SE-FRET-effektivitet kodet i en pseudofargeskala. På denne skalaen tilsvarer overgangen fra blått til rødt en økning i FRET-effektiviteten, et mål på protein-protein nærhet fra 0% til 100%. I dette representative eksperimentet ble SE-FRET-signalet registrert i cellekje…

Discussion

Denne FRET-protokollen er enkel og lett å reprodusere; Det krever også minimal forsyningsinvestering og bruker standardutstyr for mange moderne laboratorier. Spesielt skiller fem hovedtekniske funksjoner allsidigheten til denne prosedyren. For det første genereres FRET-konstruksjonene ved hjelp av stedsspesifikk rekombinasjon, en kloningsmetode som er enkel å bruke, gir nøyaktige resultater og sparer tid sammenlignet med tradisjonell restriksjonsenzymbasert kloning. For det andre er N. benthamiana-planter e…

Materials

Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone)	Sigma-Aldrich	#D134406-1G
Bacto Agar	BD Biosciences	#214010
Bacto trypton	BD Biosciences	#211705
Bacto yeast extract	BD Biosciences	#212750
Confocal laser scanning microscope (CLSM)	Zeiss	LSM900	Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105	VWR	104013-310	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II	Invitrogen	#11789100
Gateway LR Clonase II	Invitrogen	#11791020
GV3101	VWR	104013-296	We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ			https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES	Sigma-Aldrich	#69889-10G
MgCl2	Sigma-Aldrich	#63068-250G
NaCl	Sigma-Aldrich	#S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds	Herbalistics Pty	RA4 or LAB	We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207	Invitrogen	#12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1	N/A		Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1	N/A		Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin	Sigma-Aldrich	#R7382-5G
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	#S4014-5G
Syringes without needles	BD	309659
Zen software for CLSM imaging	Zeiss	ZEN 3.0 version	The software should be compatible with the CLSM used