Ikke-invasiv ultralydsvurdering af endometriecancerprogression i Pax8-rettet deletion af tumorsuppressorerne Arid1a og Pten hos mus
Summary
Denne protokol beskriver en metode til overvågning af progressionen af morfologiske ændringer over tid i livmoderen i en inducerbar musemodel af endometriecancer ved hjælp af ultralydsbilleddannelse med korrelation til grove og histologiske ændringer.
Abstract
Livmoderkræft kan undersøges hos mus på grund af den lette håndtering og genetiske manipulation i disse modeller. Imidlertid er disse undersøgelser ofte begrænset til at vurdere patologi post mortem hos dyr, der aflives på flere tidspunkter i forskellige kohorter, hvilket øger antallet af mus, der er nødvendige for en undersøgelse. Billeddannelse af mus i longitudinelle undersøgelser kan spore sygdomsudviklingen hos individuelle dyr, hvilket reducerer antallet af mus, der er nødvendige. Fremskridt inden for ultralydsteknologi har gjort det muligt at detektere ændringer på mikrometerniveau i væv. Ultralyd er blevet brugt til at studere follikelmodning i æggestokke og xenograftvækst, men er ikke blevet anvendt til morfologiske ændringer i muselivmoderen. Denne protokol undersøger sammenstillingen af patologi med in vivo billeddannelsessammenligninger i en induceret endometriecancermusemodel. De funktioner, der blev observeret ved ultralyd, var i overensstemmelse med graden af ændring set ved grov patologi og histologi. Ultralyd viste sig at være meget forudsigelig for den observerede patologi, hvilket understøtter inkorporeringen af ultralyd i langsgående undersøgelser af livmodersygdomme som kræft hos mus.
Introduction
Mus er fortsat en af de vigtigste dyremodeller for reproduktionsforstyrrelser 1,2,3. Der er flere genetisk modificerede eller inducerede gnavermodeller af kræft i æggestokkene og livmoderen. Disse undersøgelser er typisk afhængige af flere kohorter, der aflives på forskellige tidspunkter for at fange langsgående tendenser i morfologiske og patologiske ændringer. Dette forhindrer evnen til at erhverve kontinuerlige data om kræftudvikling i en individuel mus. Uden at kende den enkelte musesygdoms progressionstilstand er interventionsstudierne desuden baseret på forudbestemte tidspunkter og gennemsnitlige fund fra tidligere kohorter snarere end individuelle tærskler for påvisning af progression i et specifikt dyr 4,5. Derfor er der behov for billeddannelsesmetoder, der muliggør langsgående vurdering i levende dyr, for at lette prækliniske modeller til test af nye lægemidler eller forbindelser og fremskynde forståelsen af patobiologi og samtidig øge stringensen og reproducerbarheden6.
Ultralydsbilleddannelse (US) er en tiltalende metode til langsgående overvågning af muselivmoderkræftprogression, fordi den er relativt let og billig sammenlignet med andre billeddannelsesmetoder, er let at udføre og kan have bemærkelsesværdig opløsning 6,7. Denne ikke-invasive modalitet kan fange funktioner til mikronskalaen hos vågne mus eller med mus under kort sedation ved hjælp af en 5-10 minutters eksamen. Ultralydmikroskopi er blevet valideret som en metode til måling af musens ovariefollikeludvikling 8 og væksten af implanteret eller induceret neoplasi 9,10,11. Højfrekvent ULer også blevet anvendt til perkutane intrauterin injektioner12 og observation af rotteuterin ændring i løbet af østruscyklussen13. Højfrekvent US kan bruges med mus, der holdes på specialiserede stationære platforme ved hjælp af et skinnesystem til at holde transduceren / sonden for at optage billeder i høj opløsning med standardiseret position og tryk; Dette udstyr er dog ikke tilgængeligt på alle institutioner. Håndholdte transducerscanningsmetoder kan anvendes med mindre dedikeret udstyr og anvendes til både klinisk diagnostik og forskningsapplikationer i mus.
Spørgsmålet er stadig, om amerikansk billeddannelse med håndholdte, højfrekvente sonder kan bruges til at overvåge livmoderkræftudvikling over flere uger. I lighed med tarmene er gnaverlivmoderen en tyndvægget, slank struktur, der er meget mobil i maven og er sammenhængende gennem flere vævsdybder, hvilket gør billeddannelse mere udfordrende end med relativt immobile organer som nyrerne. Denne undersøgelse søgte at fastslå sammenhængen mellem væv observeret ved ultralyd og histopatologi, definere landemærker til lokalisering af muselivmoderen og bestemme gennemførligheden af den langsgående vurdering af endometriecancer. Denne undersøgelse præsenterer data, der viser en kvalitativ korrespondance mellem udseendet af uteri afbildet af US og histopatologi samt seriel billeddannelse af mus over flere uger. Disse resultater indikerer, at håndholdt ULkan bruges til at overvåge endometriecancerudvikling hos mus, hvilket skaber mulighed for at indsamle individuelle musens langsgående data for at studere livmoderkræft uden behov for dedikeret udstyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol undersøger nytten af ultralyd til vurdering af livmodermorfologiske ændringer i progressionen af adenocarcinom i livmoderen hos mus. I denne undersøgelse, ved at følge induktionen af endometriecancer hos mus i længderetningen, viste de anatomiske detaljer detekteret ved ultralyd sig at være indikatorer for grov og histologisk patologi. Dette åbner døren for brugen af langsgående undersøgelser med mindre antal mus overvåget af ultralyd på flere tidspunkter for at følge udviklingen af livmoderkr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for finansiering fra NCI Ovarian Cancer SPORE Program P50CA228991, postdoktoralt træningsprogram 5T32OD011089 og Richard W. TeLinde Endowment, Johns Hopkins University. Projektet blev også delvist finansieret af tilskud til løbende udgifter til private højere læreanstalter fra Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
