Evaluación ecográfica no invasiva de la progresión del cáncer de endometrio en la deleción dirigida por Pax8 de los supresores tumorales Arid1a y Pten en ratones
Summary
Este protocolo describe un método para monitorear la progresión de los cambios morfológicos a lo largo del tiempo en el útero en un modelo de ratón inducible de cáncer de endometrio utilizando imágenes de ultrasonido con correlación con cambios macroscópicos e histológicos.
Abstract
Los cánceres uterinos se pueden estudiar en ratones debido a la facilidad de manejo y manipulación genética en estos modelos. Sin embargo, estos estudios a menudo se limitan a evaluar la patología post mortem en animales sacrificados en múltiples puntos de tiempo en diferentes cohortes, lo que aumenta el número de ratones necesarios para un estudio. Las imágenes de ratones en estudios longitudinales pueden rastrear la progresión de la enfermedad en animales individuales, reduciendo el número de ratones necesarios. Los avances en la tecnología de ultrasonido han permitido la detección de cambios a nivel micrométrico en los tejidos. El ultrasonido se ha utilizado para estudiar la maduración del folículo en los ovarios y el crecimiento del xenoinjerto, pero no se ha aplicado a los cambios morfológicos en el útero del ratón. Este protocolo examina la yuxtaposición de la patología con comparaciones de imágenes in vivo en un modelo de ratón con cáncer de endometrio inducido. Las características observadas por ultrasonido fueron consistentes con el grado de cambio observado por patología macroscópica e histología. Se encontró que el ultrasonido era altamente predictivo de la patología observada, apoyando la incorporación de la ecografía en estudios longitudinales de enfermedades uterinas como el cáncer en ratones.
Introduction
Los ratones siguen siendo uno de los modelos animales más importantes para los trastornos reproductivos 1,2,3. Hay varios modelos de roedores genéticamente modificados o inducidos de cáncer de ovario y útero. Estos estudios generalmente se basan en múltiples cohortes sacrificadas en diferentes puntos de tiempo para capturar tendencias longitudinales en cambios morfológicos y patológicos. Esto impide la capacidad de adquirir datos continuos sobre el desarrollo del cáncer en un ratón individual. Además, sin conocer el estado de progresión de la enfermedad individual en ratones, los estudios de intervención se basan en puntos de tiempo predeterminados y hallazgos promediados de cohortes anteriores en lugar de umbrales individuales para la detección de progresión en un animal específico 4,5. Por lo tanto, los enfoques de imagen que permiten la evaluación longitudinal en animales vivos son necesarios para facilitar los modelos preclínicos para probar nuevos fármacos o compuestos y acelerar la comprensión de la patobiología, al tiempo que aumentan el rigor y la reproducibilidad6.
La ecografía (ecografía) es un método atractivo para la monitorización longitudinal de la progresión del cáncer uterino de ratón porque es relativamente fácil y económico en comparación con otros métodos de imagen, es fácil de realizar y puede tener una resolución notable 6,7. Esta modalidad no invasiva puede capturar características a escala de micras en ratones despiertos o con ratones bajo sedación breve mediante un examen de 5-10 minutos. La microscopía ecográfica ha sido validada como un método para medir el desarrollo del folículo ovárico de ratón 8 y el crecimiento de neoplasia implantada o inducida 9,10,11. La ecografía de alta frecuencia también se ha utilizado para inyecciones intrauterinas percutáneas12 y para observar el cambio uterino de ratas durante el ciclo estral13. La US de alta frecuencia se puede utilizar con ratones sostenidos en plataformas estacionarias especializadas utilizando un sistema de rieles para sostener el transductor / sonda para capturar imágenes de alta resolución con posición y presión estandarizadas; Sin embargo, este equipo no está disponible en todas las instituciones. Los métodos de escaneo de transductores de mano se pueden adoptar con equipos menos dedicados y se pueden usar tanto para diagnósticos clínicos como para aplicaciones de investigación en ratones.
La pregunta sigue siendo si las imágenes estadounidenses con sondas portátiles de alta frecuencia podrían usarse para monitorear el desarrollo del cáncer uterino durante varias semanas. Similar a los intestinos, el útero de roedores es una estructura delgada y de paredes delgadas que es muy móvil dentro del abdomen y es contigua a través de múltiples profundidades de tejido, lo que hace que las imágenes sean más difíciles que con órganos relativamente inmóviles como los riñones. Este estudio buscó establecer la correlación entre los tejidos observados por ultrasonido e histopatología, definir puntos de referencia para localizar el útero de ratón y determinar la viabilidad de la evaluación longitudinal del cáncer de endometrio. Este estudio presenta datos que muestran una correspondencia cualitativa entre la aparición de úteros fotografiados por US y la histopatología, así como imágenes seriadas de ratones durante varias semanas. Estos resultados indican que la ecografía portátil se puede utilizar para monitorear el desarrollo del cáncer de endometrio en ratones, creando así una oportunidad para recopilar datos longitudinales individuales de ratón para estudiar el cáncer uterino sin la necesidad de equipos dedicados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo examina la utilidad del ultrasonido para evaluar los cambios morfológicos uterinos en la progresión del adenocarcinoma en el útero en ratones. En este estudio, al seguir longitudinalmente la inducción del cáncer de endometrio en ratones, se encontró que los detalles anatómicos detectados por ultrasonido eran indicadores de patología macroscópica e histológica. Esto abre la puerta para el uso de estudios longitudinales con un número menor de ratones monitoreados por ultrasonido en múltiples punt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos los fondos del Programa SPORE de Cáncer de Ovario del NCI P50CA228991, el programa de capacitación postdoctoral 5T32OD011089 y la Fundación Richard W. TeLinde, Universidad Johns Hopkins. El proyecto también fue financiado en parte por los subsidios para gastos corrientes a instituciones privadas de educación superior de la Corporación de Promoción y Ayuda Mutua para Escuelas Privadas de Japón.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
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