הערכת אולטרסאונד לא פולשנית של התקדמות סרטן רירית הרחם במחיקה מכוונת Pax8 של מדכאי הגידול Arid1a ו - Pten בעכברים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר התקדמות שינויים מורפולוגיים לאורך זמן ברחם במודל עכברי מושרה של סרטן רירית הרחם באמצעות הדמיית אולטרסאונד עם קורלציה לשינויים גסים והיסטולוגיים.
Abstract
סרטן הרחם יכול להיחקר בעכברים בשל קלות הטיפול והמניפולציה הגנטית במודלים אלה. עם זאת, מחקרים אלה מוגבלים לעתים קרובות להערכת פתולוגיה לאחר המוות בבעלי חיים שהומתו בנקודות זמן מרובות בקבוצות שונות, מה שמגדיל את מספר העכברים הדרושים למחקר. הדמיה של עכברים במחקרי אורך יכולה לעקוב אחר התקדמות המחלה בבעלי חיים בודדים, ולהפחית את מספר העכברים הדרושים. ההתקדמות בטכנולוגיית האולטרסאונד אפשרה זיהוי של שינויים ברמת המיקרומטר ברקמות. אולטרסאונד שימש לחקר הבשלת זקיקים בשחלות וצמיחת קסנוגרפט, אך לא יושם על שינויים מורפולוגיים ברחם העכבר. פרוטוקול זה בוחן את הסמיכות של פתולוגיה עם השוואות הדמיה in vivo במודל עכבר סרטן רירית הרחם המושרה. המאפיינים שנצפו על ידי אולטרסאונד היו עקביים עם מידת השינוי שנצפתה על ידי פתולוגיה גסה והיסטולוגיה. אולטרסאונד נמצא כמנבא מאוד את הפתולוגיה הנצפית, ותומך בשילוב אולטרה-סאונד במחקרי אורך של מחלות רחם כגון סרטן בעכברים.
Introduction
עכברים נותרו אחד המודלים החשובים ביותר של בעלי חיים להפרעות רבייה 1,2,3. ישנם מספר מודלים מהונדסים גנטית או מושרית מכרסמים של סרטן השחלות והרחם. מחקרים אלה מסתמכים בדרך כלל על קבוצות מרובות שהומתו בנקודות זמן שונות כדי ללכוד מגמות אורך בשינויים מורפולוגיים ופתולוגיים. זה מונע את היכולת לרכוש נתונים רציפים על התפתחות סרטן בעכבר בודד. בנוסף, מבלי לדעת את מצב התקדמות מחלת העכבר הבודד, מחקרי התערבות מבוססים על נקודות זמן קבועות מראש וממצאים ממוצעים של קבוצות קודמות ולא על סף בודד לזיהוי התקדמות בחיה ספציפית 4,5. לכן, יש צורך בגישות הדמיה המאפשרות הערכת אורך בבעלי חיים כדי להקל על מודלים פרה-קליניים לבדיקת תרופות או תרכובות חדשות ולהאיץ את הבנת הפתולוגיה תוך הגברת ההקפדה והשכפול6.
הדמיית אולטרסאונד (US) היא שיטה מושכת לניטור אורכי של התקדמות סרטן הרחם בעכבר מכיוון שהיא קלה יחסית וזולה בהשוואה לשיטות הדמיה אחרות, קלה לביצוע ויכולה להיות ברזולוציה יוצאת דופן 6,7. שיטה לא פולשנית זו יכולה ללכוד תכונות בקנה מידה מיקרוני בעכברים ערים או עם עכברים תחת טשטוש קצר באמצעות בדיקה של 5-10 דקות. מיקרוסקופ אולטרסאונד אומת כשיטה למדידת התפתחות זקיק השחלות של עכבר 8 וצמיחת ניאופלזיה מושתלת או מושרית 9,10,11. US בתדירות גבוהה שימש גם לזריקות תוך רחמיות מלעוריות12 ולצפייה בשינוי רחם חולדה במהלך מחזור הייחום13. ניתן להשתמש בארה”ב בתדר גבוה עם עכברים המוחזקים על פלטפורמות נייחות מיוחדות באמצעות מערכת מסילות להחזקת המתמר / הגשושית כדי לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה עם מיקום ולחץ סטנדרטיים; עם זאת, ציוד זה אינו זמין בכל המוסדות. ניתן לאמץ שיטות סריקת מתמרים ידניות עם ציוד פחות ייעודי ולהשתמש בהן הן לאבחון קליני והן ליישומי מחקר בעכברים.
נשאלת השאלה האם ניתן להשתמש בהדמיה אמריקאית עם בדיקות ידניות בתדירות גבוהה כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן הרחם במשך שבועות רבים. בדומה למעיים, הרחם המכרסם הוא מבנה דק ודק שהוא נייד מאוד בתוך הבטן והוא רציף דרך עומקי רקמות מרובים, מה שהופך את ההדמיה למאתגרת יותר מאשר עם איברים חסרי תנועה יחסית כמו הכליות. מחקר זה ביקש לקבוע את המתאם בין רקמות שנצפו על ידי אולטרסאונד והיסטופתולוגיה, להגדיר ציוני דרך לאיתור רחם העכבר ולקבוע את היתכנות ההערכה האורכית של סרטן רירית הרחם. מחקר זה מציג נתונים המראים התאמה איכותית בין הופעת הרחם שצולם על ידי US לבין היסטופתולוגיה, כמו גם הדמיה סדרתית של עכברים במשך מספר שבועות. תוצאות אלה מצביעות על כך שניתן להשתמש ב- US ידני כדי לעקוב אחר התפתחות סרטן רירית הרחם בעכברים, ובכך ליצור הזדמנות לאיסוף נתוני אורך של עכברים בודדים לחקר סרטן הרחם ללא צורך בציוד ייעודי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה בוחן את התועלת של אולטרסאונד להערכת שינויים מורפולוגיים ברחם בהתקדמות אדנוקרצינומה ברחם בעכברים. במחקר זה, על ידי מעקב אחר השראת סרטן רירית הרחם בעכברים לאורך זמן, הפרטים האנטומיים שזוהו על ידי אולטרסאונד נמצאו כאינדיקטורים לפתולוגיה גסה והיסטולוגית. זה פותח את הדלת לשימוש ב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על המימון מתוכנית SPORE לסרטן השחלות של NCI P50CA228991, תוכנית הכשרה לפוסט-דוקטורט 5T32OD011089, וקרן ריצ’רד וו. TeLinde, אוניברסיטת ג’ונס הופקינס. הפרויקט מומן בחלקו גם על ידי סובסידיות להוצאות שוטפות למוסדות פרטיים להשכלה גבוהה מהתאגיד לקידום ועזרה הדדית לבתי ספר פרטיים של יפן.
Materials
| Reagents and Equipment Used for Animal Care | |||
| Rodent Diet (2018, 625 Doxycycline) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | Isotonic Fluid |
| Absorbent Pad with Plastic Backing | Daigger | EF8313 | Absorbant Pads |
| Anesthesia Induction Chambers | Harvard Apparatus | 75-2029 | Induction Chamber |
| Anesthetic absorber kit with absorber canister, holder, tubing, & adapters | CWE, Inc | 13-20000 | Nose Cone and Tubing |
| Aquasonic Clear Ultrasound Gel (0.25 Liter) | Parker Laboratoies | 08-03 | Ultrasound Gel |
| BD Plastipak 3 mL Syringe | BD Biosciences | 309657 | Syringe |
| F/Air Scavenger Charcoal Canister | OMNICON | 80120 | Scavenging System for Anesthesia |
| Isoflurane, USP | Vet One | 502017 | Anesthesia Agent |
| M1050 Non-Rebreathing Mobile Anesthesia Machine | Scivena Scientific | M1050 | Anestheic Vaporizer |
| MX550S, 25-55 MHz Transducer, 15mm, Linear | VisualSonics | MX550S | Ultrasound Transducer (Probe) |
| Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion – 9.0 oz | Nair | Depilliating Cream | |
| Philips Norelco Multigroomer All-in-One Trimmer Series 7000 | Philips North America | MG7750 | Clippers |
| PrecisionGlide 25 G 1" Needle | BD Biosciences | 305125 | Needle |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Lubricating Eye Drops |
| Vevo 3100 Imaging System | VisualSonics | Vevo 3100 | Ultrasound Machine |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | Ultrasound Analysis Software |
| Vinyl Heating Pad with cover, 12 x 15" | Sunbeam | 731-500-000R | Heating Pad |
| Wd Elements 2TB Basic Storage | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | Data Storage |
| Reagents and Equipment Used for Immunohistochemistry | |||
| 10% w/v Formalin | Fischer Scientific | SF98-4 | Tissue Fixation Buffer |
| Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U. | Vector Laboratories Inc. | SP5035 | Antibody Blocker |
| Charged Super Frost Plus Glass Slides | VWR | 4831-703 | Tissue Mounting Slides |
| Citrate Buffer | MilliporeSigma | C9999-1000ML | Epitope Retrival Buffer (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | Resin for Slide Sealing |
| Gold Seal Cover Glass | Thermo Scientific | 3322 | Coverslide |
| Harris Modified Hematoxylin | MilliporeSigma | HHS32-1L | Counterstain Buffer |
| Hybridization Incubator (Dual Chamber) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | Oven to Melt Parraffin |
| ImmPACT DAB Substrate, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | Signal Development Substrate |
| ImmPRESS HRP Goat Anti-Rabbit IgG Polymer Detection Kit, Peroxidase | Vector Laboratories Inc. | MP-7451 | Secondary IHC Antibody |
| Oster 5712 Digital Food Steamer | Oster | 5712 | Vegetable Steamer for Epitope Retrival |
| rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | Primary IHC Antibody (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | Primary IHC Antibody (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | Epitope Retrival Buffer (ARID1a) |
References
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intrauterine adhesive pathology. Annals of Translational Medicine. 8 (18), 1125 (2020).
- Shi, D., Vine, D. F. Animal models of polycystic ovary syndrome: a focused review of rodent models in relationship to clinical phenotypes and cardiometabolic risk. Fertility and Sterility. 98 (1), 185-193 (2012).
- Greco, A., et al. Ultrasound biomicroscopy in small animal research: applications in molecular and preclinical imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 519238 (2012).
- Palsdottir, K., et al. Interobserver agreement of transvaginal ultrasound and magnetic resonance imaging in local staging of cervical cancer. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 58 (5), 773-779 (2021).
- Gabrielson, K., et al. In vivo imaging with confirmation by histopathology for increased rigor and reproducibility in translational research: A review of examples, options, and resources. ILAR Journal. 59 (1), 80-98 (2018).
- Peterson, R. A., et al. Continuing education course #1: Non-invasive imaging as a problem-solving tool and translational biomarker strategy in toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 39 (1), 267-272 (2011).
- Pfeifer, L. F., Adams, G. P., Pierson, R. A., Singh, J. Ultrasound biomicroscopy: A non-invasive approach for in vivo evaluation of oocytes and small antral follicles in mammals. Reproduction, Fertility and Development. 26 (1), 48-54 (2013).
- Cheung, A. M., et al. Three-dimensional ultrasound biomicroscopy for xenograft growth analysis. Ultrasound in Medicine and Biology. 31 (6), 865-870 (2005).
- Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106 (2009).
- Wu, G., Wang, L., Yu, L., Wang, H., Xuan, J. W. The use of three-dimensional ultrasound micro-imaging to monitor prostate tumor development in a transgenic prostate cancer mouse model. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 207 (3), 181-189 (2005).
- Rinaldi, S. F., et al. Ultrasound-guided intrauterine injection of lipopolysaccharide as a novel model of preterm birth in the mouse. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1201-1206 (2015).
- Wang, T., et al. Ultrasonography in experimental reproductive investigations on rats. Journal of Visualized Experiments. 130, e56038 (2017).
- Suryo Rahmanto, Y., et al. Inactivation of Arid1a in the endometrium is associated with endometrioid tumorigenesis through transcriptional reprogramming. Nature Communications. 11, 2717 (2020).
- Pani, F., et al. Pre-existing thyroiditis ameliorates papillary thyroid cancer: Insights from a new mouse model. Endocrinology. 162 (10), bqab144 (2021).
