利用荧光 原位 杂交探索卵巢细胞中的X染色体畸变
Summary
本文提出了两种基于荧光 原位 杂交的方法，以确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞的X染色体含量。
Abstract
全世界有数百万人处理有关生育的问题。生育能力下降，甚至不孕症，可能是由于许多不同的原因，包括遗传性疾病，其中染色体异常是最常见的。荧光 原 位杂交（FISH）是检测人类染色体畸变的众所周知且常用的方法。FISH主要用于分析具有数值或结构染色体畸变的雄性精子中的染色体异常。此外，该技术也经常应用于女性，以检测已知会导致卵巢发育不良的X染色体畸变。然而，仍然缺乏关于淋巴细胞和/或颊细胞中X染色体畸变的女性卵巢细胞的X染色体含量的信息。
本研究的目的是通过提出两种基于FISH的方法来鉴定卵巢细胞的X染色体含量，从而推进有关女性X染色体畸变的基础研究。首先，描述了一种测定X染色体畸变女性非移植卵巢皮层组织中分离的卵巢细胞（卵母细胞，颗粒细胞和基质细胞）的X染色体含量的方法。第二种方法旨在通过确定卵巢组织中新形成的二级和窦卵泡的卵巢细胞的X染色体含量来评估染色体畸变对卵泡发生的影响，这些卵巢组织中来自长期移植到免疫功能低下小鼠后具有X染色体畸变的雌性。这两种方法都可能有助于未来的研究，以深入了解具有X染色体畸变的女性的生殖潜力。
Introduction
不孕症是男性或女性生殖系统的健康问题，影响全世界约1.86亿育龄人1。在至少35%的不孕夫妇中，不孕症是由女性生殖系统疾病引起的2。导致女性不孕的因素很多，如遗传因素、生殖道异常、内分泌功能障碍、炎症性疾病、医源性治疗等3。
遗传异常存在于大约 10% 的不育女性中4，5。在所有遗传异常中，X染色体畸变是卵巢发育不全的最常见原因2。一些研究报告，患有特纳综合征 （TS） 或三重 X 综合征的女性的 X 染色体畸变与生殖细胞加速丢失或卵子生成受损导致的卵巢早衰有关6，7，8。
X染色体畸变可分为：1）数值畸变，其中X染色体数量不同但X染色体完整;2）结构畸变，其中X染色体获得或失去遗传物质3，9。X染色体的数值畸变比结构异常更常见，通常是由细胞分裂过程中的自发错误引起的3，9。当减数分裂期间发生这种错误时，可能会导致非整倍体配子，并最终导致所有细胞中染色体畸变的后代。当体细胞中由于个体发生早期有丝分裂过程中发生的错误而导致体细胞中出现染色体缺陷时，可能会导致嵌合体。在这些个体中，存在具有正常X染色体含量的细胞和具有X染色体畸变的细胞。
在 1980 年代，开发了一种称为荧光 原位 杂交 （FISH） 的细胞遗传学技术，用于可视化和定位中期和间期染色体10，11 上的特定核酸序列。该技术使用荧光标记的DNA探针与染色体中的特定序列结合，然后可以使用荧光显微镜将其可视化。
如今，FISH被广泛用作临床诊断工具，被认为是检测染色体畸变的金标准10。在生殖医学领域，对精子的FISH分析已被用于深入了解体细胞中具有数字或结构染色体畸变的男性精子的X染色体含量12，13，14。这些研究表明，与具有正常核型12，13，14的男性相比，染色体畸变的男性更有可能在其精液中出现更高的非整倍体精子的频率。
与精子相反，对染色体畸变个体卵巢细胞（包括卵母细胞、颗粒/膜细胞和基质细胞）的 X 染色体含量知之甚少，以及这些细胞的非整倍性对其生殖潜力的可能后果。与精子相比，卵巢细胞核型信息稀缺的一个重要原因是女性必须接受侵入性手术，例如卵泡穿刺或手术以获得卵母细胞或卵巢皮层组织。因此，很难获得用于研究目的的雌配子。
目前，荷兰正在进行一项观察性干预研究，以探索卵巢组织冷冻保存对TS15年轻女性的疗效。患者的卵巢皮层组织的一个片段可用于鉴定卵巢细胞的X染色体含量16，17。作为研究的一部分，开发了一种基于解离卵巢皮层组织的FISH的新方法，以确定在非卵巢体细胞（如淋巴细胞或颊细胞）中携带染色体畸变的女性卵巢细胞中是否存在染色体畸变。此外，还确定了卵巢细胞中非整倍性对卵泡生成的影响。为此，修改了一个已建立的FISH方案，以便在免疫功能低下的小鼠长期异种移植期间人工诱导的卵泡生成后分析卵巢皮层组织的组织学切片。在这项研究中，我们提出了两种基于FISH的方法来确定X染色体畸变女性非移植和移植卵巢皮层组织中卵巢细胞中的X染色体含量，旨在提高该主题的基础科学。
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH 分析是一种众所周知的技术，用于检测男性和女性淋巴细胞或颊细胞中的 X 染色体畸变10.一些研究已经描述了FISH对X染色体畸变的男性配子的影响，但FISH获得的关于X染色体畸变女性卵巢细胞的详细信息仍然缺乏14。本文提出了基于FISH的新方法，以确定X染色体畸变女性的非移植和移植卵巢皮层组织的卵巢细胞中是否存在非整倍性。
在非?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Marjo van Brakel，Dominique Smeets，Guillaume van de Zande，Patricia van Cleef和Milan Intezar的专业知识和技术援助。资金来源：默克雪兰诺（A16-1395），Goodlife和Ferring。
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
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