Explorando aberrações cromossômicas X em células ovarianas usando hibridização in situ fluorescente
Summary
Este artigo apresenta dois métodos baseados na hibridização in situ fluorescente para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas em tecido córtex ovariano não enxertado e enxertado de fêmeas com aberrações cromossômicas X.
Abstract
Milhões de pessoas em todo o mundo lidam com questões relativas à fertilidade. A redução da fertilidade, ou mesmo a infertilidade, pode ser devida a muitas causas diferentes, incluindo doenças genéticas, das quais as anormalidades cromossômicas são as mais comuns. A hibridação in situ fluorescente (FISH) é um método bem conhecido e frequentemente utilizado para detectar aberrações cromossômicas em humanos. A FISH é usada principalmente para a análise de anormalidades cromossômicas nos espermatozoides de machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais. Além disso, essa técnica também é frequentemente aplicada em mulheres para detectar aberrações cromossômicas X que sabidamente causam disgenesia ovariana. No entanto, ainda faltam informações sobre o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de mulheres com aberrações cromossômicas X em linfócitos e/ou células bucais.
O objetivo deste estudo é avançar na pesquisa básica sobre aberrações cromossômicas X em fêmeas, apresentando dois métodos baseados em FISH para identificar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas. Primeiro, um método é descrito para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas isoladas (ovócitos, células da granulosa e células estromais) em tecido do córtex ovariano não enxertado de mulheres com aberrações cromossômicas X. O segundo método é direcionado a avaliar o efeito das aberrações cromossômicas na foliculogênese, determinando o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de folículos secundários e antrais recém-formados no tecido ovariano, de fêmeas com aberrações cromossômicas X após enxertia de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Ambos os métodos podem ser úteis em pesquisas futuras para obter informações sobre o potencial reprodutivo de fêmeas com aberrações cromossômicas X.
Introduction
A infertilidade é um problema de saúde do sistema reprodutor masculino ou feminino, afetando aproximadamente 186 milhões de indivíduos em idade reprodutiva no mundo1. Em pelo menos 35% dos casais inférteis, a infertilidade é causada por um distúrbio do sistema reprodutor feminino2. Vários são os fatores que podem causar a infertilidade feminina, como fatores genéticos, anormalidades do trato genital, disfunção endócrina, doenças inflamatórias e tratamento iatrogênico3.
Anormalidades genéticas estão presentes em aproximadamente 10% das fêmeas inférteis 4,5. De todas as anormalidades genéticas, as aberrações do cromossomo X são a causa mais comum de disgenesia ovariana2. Vários estudos relatam que aberrações cromossômicas X em mulheres com síndrome de Turner (ST) ou síndrome do triplo X estão associadas à falência ovariana prematura devido à perda acelerada de células germinativas ou oogênese prejudicada 6,7,8.
As aberrações do cromossomo X podem ser divididas em: 1) aberrações numéricas, nas quais o número de cromossomos X é diferente, mas os cromossomos X estão intactos; e 2) aberrações estruturais, nas quais o cromossomo X ganhou ou perdeu material genético 3,9. As aberrações numéricas do cromossomo X são mais comuns que as anormalidades estruturais e são frequentemente causadas por erros espontâneos durante a divisão celular 3,9. Quando este erro ocorre durante a meiose, pode levar a gametas aneuplóides e, finalmente, a descendentes com aberrações cromossômicas em todas as células. Quando defeitos cromossômicos surgem em células somáticas como resultado de erros que ocorrem durante a mitose nos estágios iniciais da ontogênese, isso pode levar ao mosaicismo. Nesses indivíduos, tanto células com conteúdo cromossômico X normal quanto células com aberrações cromossômicas X estão presentes.
Na década de 1980, uma técnica citogenética chamada hibridização in situ fluorescente (FISH) foi desenvolvida para visualizar e localizar sequências específicas de ácidos nucléicos em cromossomos metafásicos e interfásicos10,11. Essa técnica usa sondas de DNA marcadas com fluorescência para se ligar a uma sequência específica no cromossomo, que pode ser visualizada usando um microscópio de fluorescência.
Atualmente, a FISH é amplamente utilizada como ferramenta diagnóstica clínica e considerada o padrão-ouro na detecção de aberrações cromossômicas10. No campo da medicina reprodutiva, a análise de FISH em espermatozoides tem sido utilizada para obter informações sobre o conteúdo cromossômico X dos espermatozoides em machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais em células somáticas12,13,14. Esses estudos mostraram que homens com aberrações cromossômicas eram mais propensos a ter uma maior frequência de espermatozoides aneuploides presentes em seu sêmen em comparação com homens com cariótipos normais12,13,14.
Em contraste com os espermatozoides, muito pouco se sabe sobre o conteúdo cromossômico X das células ovarianas (incluindo ovócitos, células granulosas/tecais e células estromais) em indivíduos com aberração cromossômica, bem como as possíveis consequências das aneuploidias dessas células sobre seu potencial reprodutivo. Uma razão importante para a escassa informação sobre o cariótipo das células ovarianas em comparação com os espermatozoides é o fato de que as mulheres têm que se submeter a um procedimento invasivo, como uma punção do folículo ou cirurgia para obter ovócitos ou tecido do córtex ovariano. Os gametas femininos são, portanto, de difícil obtenção para fins de pesquisa.
Atualmente, um estudo observacional de intervenção está sendo realizado na Holanda para explorar a eficácia da criopreservação do tecido ovariano em mulheres jovens com ST15. Um fragmento de tecido do córtex ovariano da paciente estava disponível para identificar o conteúdo cromossômico X das células ovarianas16,17. Como parte do estudo, um novo método foi desenvolvido com base em FISH do tecido dissociado do córtex ovariano para determinar se aberrações cromossômicas estão presentes em células ovarianas em fêmeas portadoras de uma aberração cromossômica em células somáticas não ovarianas, como linfócitos ou células bucais. Além disso, o efeito das aneuploidias nas células ovarianas sobre a foliculogênese também foi determinado. Para este fim, um protocolo de FISH estabelecido foi modificado que permite a análise de cortes histológicos do tecido do córtex ovariano após foliculogênese artificialmente induzida durante xenotransplante de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Neste estudo, apresentamos dois métodos baseados em FISH para determinar o conteúdo cromossômico X em células ovarianas em tecido do córtex ovariano não enxertado e enxertado em mulheres com aberrações cromossômicas X, com o objetivo de aprimorar a ciência básica sobre este tema.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise de FISH é uma técnica bem conhecida para detectar aberrações cromossômicas X em linfócitos ou células bucais de homens e mulheres10. Vários estudos descreveram FISH em gametas de machos com aberrações cromossômicas X, mas informações detalhadas obtidas por FISH em células ovarianas de fêmeas com aberrações cromossômicas X ainda são escassas14. Este artigo apresenta novos métodos baseados em FISH para determinar se aneuploidias estão presentes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef e Milan Intezar por sua experiência e assistência técnica. Fontes de financiamento: Merck Serono (A16-1395), Goodlife e Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
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