Изучение Х-хромосомных аберраций в клетках яичников с использованием флуоресцентной гибридизации in situ
Summary
В данной статье представлены два метода, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ , для определения содержания Х-хромосомы клеток яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями.
Abstract
Миллионы людей во всем мире сталкиваются с проблемами, связанными с рождаемостью. Снижение фертильности или даже бесплодие может быть вызвано множеством различных причин, включая генетические нарушения, из которых хромосомные аномалии являются наиболее распространенными. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является хорошо известным и часто используемым методом обнаружения хромосомных аберраций у людей. FISH в основном используется для анализа хромосомных аномалий в сперматозоидах самцов с числовыми или структурными хромосомными аберрациями. Кроме того, этот метод также часто применяется у женщин для обнаружения аберраций Х-хромосомы, которые, как известно, вызывают дисгенезию яичников. Однако информация о содержании Х-хромосомы клеток яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями в лимфоцитах и/или буккальных клетках по-прежнему отсутствует.
Целью данного исследования является продвижение фундаментальных исследований аберраций Х-хромосомной кислоты у женщин, путем представления двух методов, основанных на FISH, для идентификации содержания Х-хромосом в клетках яичников. Во-первых, описан способ определения содержания Х-хромосомы изолированных клеток яичников (ооцитов, гранулезных клеток и стромальных клеток) в нетрансплантированной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями. Второй метод направлен на оценку влияния хромосомных аберраций на фолликулогенез путем определения Х-хромосомного содержания клеток яичников новообразованных вторичных и антральных фолликулов в ткани яичника от самок с Х-хромосомными аберрациями после длительной трансплантации в мышей с ослабленным иммунитетом. Оба метода могут быть полезны в будущих исследованиях, чтобы получить представление о репродуктивном потенциале женщин с аберрациями Х-хромосомы.
Introduction
Бесплодие – это проблема мужской или женской репродуктивной системы, затрагивающая примерно 186 миллионов человек репродуктивного возраставо всем мире 1. Не менее чем у 35% бесплодных пар бесплодие вызвано расстройством женской репродуктивнойсистемы2. Существует множество факторов, которые могут вызвать женское бесплодие, такие как генетические факторы, аномалии половых путей, эндокринная дисфункция, воспалительные заболевания и ятрогенное лечение3.
Генетические аномалии присутствуют примерно у 10% бесплодных женщин 4,5. Из всех генетических аномалий аберрации Х-хромосомы являются наиболее частой причиной дисгенезии яичников2. В нескольких исследованиях сообщалось, что аберрации Х-хромосомы у женщин с синдромом Тернера (ТС) или синдромом тройной Х-хромомы связаны с преждевременной недостаточностью яичников из-за ускоренной потери половых клеток или нарушения оогенеза 6,7,8.
Аберрации Х-хромосомы можно разделить на: 1) числовые аберрации, при которых число Х-хромосом разное, но Х-хромосомы не повреждены; и 2) структурные аберрации, при которых Х-хромосома приобрела или потеряла генетический материал 3,9. Числовые аберрации Х-хромосомы встречаются чаще, чем структурные аномалии, и часто вызваны спонтанными ошибками при деленииклеток 3,9. Когда такая ошибка возникает во время мейоза, это может привести к анеуплоидным гаметам и, в конечном итоге, к потомству с хромосомными аберрациями во всех клетках. Когда хромосомные дефекты возникают в соматических клетках в результате ошибок, возникающих при митозе на ранних стадиях онтогенеза, это может привести к мозаицизму. У этих людей присутствуют как клетки с нормальным содержанием Х-хромосомы, так и клетки с аберрациями Х-хромосомы.
В 1980-х годах был разработан цитогенетический метод, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), для визуализации и определения местоположения специфических последовательностей нуклеиновых кислот на метафазных и межфазных хромосомах10,11. Этот метод использует флуоресцентные меченные ДНК-зонды для связывания с определенной последовательностью в хромосоме, которую затем можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.
В настоящее время FISH широко используется в качестве клинического диагностического инструмента и считается золотым стандартом в выявлении хромосомных аберраций10. В области репродуктивной медицины анализ спермы FISH был использован для получения представления о содержании Х-хромосом сперматозоидов у мужчин с числовыми или структурными хромосомными аберрациями в соматических клетках12,13,14. Эти исследования показали, что мужчины с хромосомными аберрациями с большей вероятностью имели более высокую частоту анеуплоидных сперматозоидов, присутствующих в сперме, по сравнению с мужчинами с нормальными кариотипами12,13,14.
В отличие от сперматозоидов, очень мало известно о содержании Х-хромосомы клеток яичников (включая ооциты, гранулезные/тека-клетки и стромальные клетки) у людей с хромосомной аберрацией, а также о возможных последствиях анеуплоидии этих клеток на их репродуктивный потенциал. Важной причиной скудности информации о кариотипе клеток яичников по сравнению со сперматозоидами является тот факт, что женщинам приходится проходить инвазивную процедуру, такую как пункция фолликулов или операция по получению ооцитов или ткани коры яичников. Поэтому женские гаметы трудно получить в исследовательских целях.
В настоящее время в Нидерландах проводится обсервационное интервенционное исследование для изучения эффективности криоконсервации ткани яичников у молодых женщин с TS15. Один фрагмент ткани коры яичников пациентки был доступен для идентификации Х-хромосомного содержимого клеток яичников16,17. В рамках исследования был разработан новый метод, основанный на FISH диссоциированной ткани коры яичников, чтобы определить, присутствуют ли хромосомные аберрации в клетках яичников у женщин, несущих хромосомную аберрацию в неяичниковых соматических клетках, таких как лимфоциты или буккальные клетки. Кроме того, было определено влияние анеуплоидии в клетках яичников на фолликулогенез. С этой целью был модифицирован установленный протокол FISH, который позволяет анализировать гистологические срезы ткани коры яичников после искусственно индуцированного фолликулогенеза во время длительной ксенотрансплантации у мышей с ослабленным иммунитетом. В этом исследовании мы представляем два метода, основанных на FISH, для определения содержания Х-хромосомы в клетках яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы, с целью улучшения фундаментальной науки по этой теме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ FISH является хорошо известным методом обнаружения Х-хромосомных аберраций в лимфоцитах или буккальных клетках как мужчин, так и женщин10. В нескольких исследованиях была описана FISH на гаметах мужчин с Х-хромосомными аберрациями, но подробная информация, полученная FIS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность Марьо ван Бракелю, Доминику Смитсу, Гийому ван де Занде, Патрисии ван Клиф и Милану Интезару за их опыт и техническую помощь. Источники финансирования: Merck Serono (A16-1395), Goodlife и Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner’s syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
