Exploración de las aberraciones cromosómicas X en células ováricas mediante el uso de hibridación fluorescente in situ
Summary
Este artículo presenta dos métodos basados en la hibridación fluorescente in situ para determinar el contenido cromosómico X de las células ováricas en tejido de la corteza ovárica no injertado e injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X.
Abstract
Millones de personas en todo el mundo se ocupan de cuestiones relacionadas con la fertilidad. La reducción de la fertilidad, o incluso la infertilidad, puede deberse a muchas causas diferentes, incluidos los trastornos genéticos, de los cuales las anomalías cromosómicas son las más comunes. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método bien conocido y utilizado con frecuencia para detectar aberraciones cromosómicas en humanos. FISH se utiliza principalmente para el análisis de anomalías cromosómicas en los espermatozoides de varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales. Además, esta técnica también se aplica con frecuencia en mujeres para detectar aberraciones cromosómicas X que se sabe que causan disgenesia ovárica. Sin embargo, todavía falta información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X en linfocitos y/o células bucales.
El objetivo de este estudio es avanzar en la investigación básica sobre las aberraciones cromosómicas X en mujeres, mediante la presentación de dos métodos basados en FISH para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas. Primero, se describe un método para determinar el contenido cromosómico X de células ováricas aisladas (ovocitos, células de la granulosa y células del estroma) en tejido de corteza ovárica no injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X. El segundo método está dirigido a evaluar el efecto de las aberraciones cromosómicas en la foliculogénesis mediante la determinación del contenido cromosómico X de las células ováricas de los folículos secundarios y antrales recién formados en el tejido ovárico, de hembras con aberraciones cromosómicas X después de un injerto a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. Ambos métodos podrían ser útiles en futuras investigaciones para obtener información sobre el potencial reproductivo de las mujeres con aberraciones cromosómicas X.
Introduction
La infertilidad es un problema de salud del sistema reproductor masculino o femenino, que afecta a aproximadamente 186 millones de personas en edad reproductiva en todo el mundo1. En al menos el 35% de las parejas infértiles, la infertilidad es causada por un trastorno del sistema reproductor femenino2. Hay muchos factores que pueden causar infertilidad femenina, como factores genéticos, anomalías del tracto genital, disfunción endocrina, enfermedades inflamatorias y tratamiento iatrogénico3.
Las anomalías genéticas están presentes en aproximadamente 10% de las hembras infértiles 4,5. De todas las anomalías genéticas, las aberraciones del cromosoma X son la causa más común de disgenesia ovárica2. Varios estudios han reportado que las aberraciones cromosómicas X en mujeres con síndrome de Turner (ST) o síndrome Triple X están asociadas con insuficiencia ovárica prematura debido a una pérdida acelerada de células germinales o alteración de la ovogénesis 6,7,8.
Las aberraciones del cromosoma X se pueden dividir en: 1) aberraciones numéricas, en las que el número de cromosomas X es diferente pero los cromosomas X están intactos; y 2) aberraciones estructurales, en las que el cromosoma X ha ganado o perdido material genético 3,9. Las aberraciones numéricas del cromosoma X son más comunes que las anomalías estructurales y a menudo son causadas por errores espontáneos durante la división celular 3,9. Cuando tal error ocurre durante la meiosis, puede conducir a gametos aneuploides y, en última instancia, a descendencia con aberraciones cromosómicas en todas las células. Cuando surgen defectos cromosómicos en las células somáticas como resultado de errores que ocurren durante la mitosis en las primeras etapas de la ontogénesis, puede conducir al mosaicismo. En estos individuos, tanto las células con contenido cromosómico X normal como las células con aberraciones cromosómicas X están presentes.
En la década de 1980, se desarrolló una técnica citogenética llamada hibridación fluorescente in situ (FISH) para visualizar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en los cromosomas de metafase e interfase10,11. Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para unirse a una secuencia específica en el cromosoma, que luego se puede visualizar mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
Hoy en día, el FISH es ampliamente utilizado como herramienta de diagnóstico clínico y es considerado el estándar de oro en la detección de aberraciones cromosómicas10. En el campo de la medicina reproductiva, el análisis FISH en espermatozoides se ha utilizado para obtener información sobre el contenido cromosómico X de los espermatozoides en varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales en células somáticas12,13,14. Estos estudios mostraron que los varones con aberraciones cromosómicas tenían más probabilidades de tener una mayor frecuencia de espermatozoides aneuploides presentes en su semen en comparación con los hombres con cariotipos normales12,13,14.
A diferencia de los espermatozoides, se sabe muy poco sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas (incluidos los ovocitos, las células granulosa/teca y las células del estroma) en individuos con una aberración cromosómica, así como las posibles consecuencias de la aneuploidía de estas células en su potencial reproductivo. Una razón importante para la escasa información sobre el cariotipo de las células ováricas en comparación con los espermatozoides es el hecho de que las mujeres tienen que someterse a un procedimiento invasivo como una punción del folículo o una cirugía para obtener ovocitos o tejido de la corteza ovárica. Los gametos femeninos son, por lo tanto, difíciles de obtener con fines de investigación.
Actualmente, se está realizando un estudio de intervención observacional en los Países Bajos para explorar la eficacia de la criopreservación del tejido ovárico en mujeres jóvenes con ST15. Un fragmento del tejido de la corteza ovárica de la paciente estaba disponible para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas16,17. Como parte del estudio, se desarrolló un nuevo método basado en FISH de tejido de corteza ovárica disociado para determinar si las aberraciones cromosómicas están presentes en las células ováricas en mujeres portadoras de una aberración cromosómica en células somáticas no ováricas, como linfocitos o células bucales. Además, también se determinó el efecto de la aneuploidía en las células ováricas sobre la foliculogénesis. Con este fin, se modificó un protocolo FISH establecido que permite el análisis de secciones histológicas de tejido de la corteza ovárica después de la foliculogénesis inducida artificialmente durante el xenotrasplante a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. En este estudio, presentamos dos métodos basados en FISH para determinar el contenido cromosómico X en células ováricas en tejido de corteza ovárica no injertado e injertado en mujeres con aberraciones cromosómicas X, con el objetivo de mejorar la ciencia básica sobre este tema.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis FISH es una técnica bien conocida para detectar aberraciones cromosómicas X en linfocitos o células bucales tanto de hombres como de mujeres10. Varios estudios han descrito FISH en gametos de varones con aberraciones cromosómicas X, pero todavía falta información detallada obtenida por FISH en células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X14. Este artículo presenta nuevos métodos basados en FISH para determinar si la aneuploidía está p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef y Milan Intezar por su experiencia y asistencia técnica. Fuentes de financiación: Merck Serono (A16-1395), Goodlife y Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
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