Summary
Multiplexerad streckkodsbildanalys har nyligen förbättrat karakteriseringen av tumörmikromiljön, vilket möjliggör omfattande studier av cellsammansättning, funktionellt tillstånd och cell-cellinteraktioner. Här beskriver vi ett färgnings- och avbildningsprotokoll som använder streckkodning av oligonukleotidkonjugerade antikroppar och cykelavbildning, vilket möjliggör användning av en högdimensionell bildanalysteknik.
Abstract
Multiplexerad bildteknik med antikroppsstreckkodning med oligonukleotider, som sekventiellt detekterar flera epitoper i samma vävnadssnitt, är en effektiv metod för tumörutvärdering som förbättrar förståelsen för tumörmikromiljön. Visualiseringen av proteinuttryck i formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader uppnås när en specifik fluorofor glödgas till en antikroppsbunden streckkod via komplementära oligonukleotider och sedan provavbildning utförs; Faktum är att denna metod möjliggör användning av anpassningsbara paneler med mer än 40 antikroppar i en enda vävnadsfärgningsreaktion. Denna metod är kompatibel med färsk frusen vävnad, formalinfixerad, paraffininbäddad vävnad, odlade celler och mononukleära celler i perifert blod, vilket innebär att forskare kan använda denna teknik för att se en mängd olika provtyper vid encellsupplösning. Denna metod börjar med ett manuellt färgnings- och fixeringsprotokoll, och alla antikroppsstreckkoder appliceras med en antikroppscocktail. Färgningsfluidikinstrumentet är helt automatiserat och utför iterativa cykler för märkning, avbildning och avlägsnande av spektralt distinkta fluoroforer tills alla biomarkörer har avbildats med hjälp av ett standardfluorescensmikroskop. Bilderna samlas sedan in och sammanställs över alla bildcykler för att uppnå encellsupplösning för alla markörer. Färgning i ett steg och skonsam borttagning av fluorofor möjliggör inte bara mycket multiplexerad biomarköranalys utan bevarar också provet för ytterligare nedströmsanalys om så önskas (t.ex. hematoxylin och eosinfärgning). Dessutom möjliggör bildanalysprogramvaran bildbehandlingskompensation, bakgrundssubtraktion, cellsegmentering och klustring samt visualisering och analys av bilder och cellfenotyper för generering av rumsliga nätverkskartor. Sammanfattningsvis använder denna teknik ett datoriserat mikrofluidiksystem och fluorescensmikroskop för att iterativt hybridisera, avbilda och strippa fluorescerande märkta DNA-sonder som kompletterar vävnadsbundna, oligonukleotidkonjugerade antikroppar.
Introduction
Tumörmikromiljön (TME) är extremt heterogen och består av tumörceller, tumörstromaceller och immunceller, immunceller, icke-cellulära komponenter i den extracellulära matrisen och många rikliga molekyler som produceras och frigörs av tumör-, stroma- och immunceller 1,2. Ackumulerande bevis visar att TME har en central roll vid omprogrammering av tumördifferentiering, tillväxt, invasion, metastasering och svar på behandlingar3.
Att förstå hur olika celltyper i TME interagerar och kommunicerar med varandra genom signalnätverk är avgörande för att förbättra cancerdiagnostik, optimera immunterapi och utveckla nya behandlingar4. Traditionella vävnadsmikroskopitekniker, inklusive immunohistokemi (IHC) och immunofluorescens (IF), har använts i årtionden för att studera celltyper, överflöd och kommunikation i tumörprover. Tyvärr kan dessa tekniker vanligtvis utvärdera endast en eller två proteinmarkörer i en vävnadssektion och kan inte avslöja de komplexa rumsliga och strukturella relationerna mellan dessa celler 5,8,7.
Under de senaste två decennierna har flera multiplexerade bildtekniker etablerats8. Dessa tekniker ger mycket bättre bilder av sammansättningen, funktionen och placeringen av immunceller i TME, vilket leder till snabba framsteg i förmågan att identifiera och rumsligt profilera komplexa TME på encellsnivå 9,10. De rumsliga och strukturella sambanden mellan olika tumörer och immunceller i TME ligger nu i framkant av biologiska och kliniska studier med hjälp av dessa multiplexerade avbildningstekniker11,12.
Den nyligen utvecklade multiplexerade avbildningstekniken med oligonukleotidkonjugerad antikroppsstreckkodning är en inflytelserik encellig biologisk forskningsplattform baserad på detektion av oligonukleotidkonjugerade antikroppar i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) prover13,14. För närvarande möjliggör denna multiplexerade bildteknik samtidig avbildning av mer än 100 markörer i en enda vävnadssektion15, vilket har ökat antalet celltyper som kan särskiljas in situ. Detta möjliggör en nivå av rumslig analys av tumör- och immunceller som inte är möjlig med traditionella immunofenotypningsmetoder16.
Här beskriver vi ett optimerat protokoll för konjugering av renade antikroppar mot oligonukleotider och validering av denna konjugering med hjälp av den multiplexerade avbildningsplattformen och en flercykelavbildningsprocedur med FFPE-vävnad. Dessutom beskriver vi de grundläggande bildbehandlings- och dataanalysprocedurerna som används med denna teknik.
Protocol
Denna retrospektiva studie godkändes av Institutional Review Board vid University of Texas MD Anderson Cancer Center. FFPE-vävnadsproverna samlades in från patienter vid MD Anderson som en del av rutinmässig standardvård. Inga diagnostiska eller terapeutiska ingrepp utfördes. Informerat samtycke erhölls från patienterna för att använda de insamlade proverna för forskning och publicering.
1. Antikroppskällor som används för antikroppspanelens design
- Skapa en antikroppspanel för multiplexerad avbildning efter noggrant övervägande av kvaliteten på vävnaderna och proteinerna av intresse. Tre källor till antikroppar beaktas för antikroppspanelens design: 1) fullt kommersiellt validerade antikroppar, 2) multiplexerade avbildningsteknologi-screenade antikroppar och 3) slutanvändardelade antikroppar.
OBS: Multiplexerade bildteknologi-screenade antikroppar har visat sig fungera och är tillgängliga från leverantörer. Dessa screenade antikroppar kan appliceras på multiplexerad bildfärgning efter oligonukleotidkonjugering av användaren. - Om ett protein av intresse inte kan hittas i källorna som nämns ovan, använd de antikroppskloner som är kända för att fungera med IHC. Dessutom rekommenderas IgG-isotyper snarare än IgM-kloner för denna multiplexerade bildteknik på grund av den högre felfrekvensen med IgM än med IgG-kloner.
2. Före antikroppskonjugering
- När du identifierar antikroppskloner för konjugering med hjälp av multiplexerade bildstreckkoder, överväg att köpa bärarfria antikroppar i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller en liknande buffert. Bärarproteiner, inklusive BSA, gluten, glycerol och andra proteintillsatser, är kända för att minska konjugeringskapaciteten.
- Välj den lämpligaste antikroppsklonen och optimera alltid färgningsförhållandena (dvs. antigenhämtning och titrering) före konjugering. Gör detta genom att applicera en okonjugerad antikroppsklon på positiv och negativ vävnad för denna antikropp med standard IF eller IHC.
OBS: Om en renad antikropp inte är kommersiellt tillgänglig måste en antikroppsreningsprocess utföras före konjugering. Reningsförfarandet som används med antikroppsreningssatser diskuteras inte här.
3. Konjugering av antikroppar
- Erhåll antikroppskonjugeringsreagenserna. Kommersiellt tillgängliga konjugeringssatser innehåller en filterblockerande lösning, reduktionslösning 2, konjugeringslösning, reningslösning, antikroppslagringslösning (allt lagrat vid 4 °C) och reduktionslösning 1 (lagrat vid −20 °C).
- Konjugation
OBS: En renad antikropp behandlas med ett reduktionsmedel, vilket gör att antikroppens reducerade delar kan reagera med den multiplexerade bildstreckkoden som används med denna teknik och därmed bilda en kovalent bindning. Denna process tar cirka 4,5 timmar och resulterar i ungefär 120 μL konjugerad antikropp, vilket är livskraftigt i 1 år. All spin-down utförs vid rumstemperatur (RT) och genomströmningen kasseras utom i det allra sista steget (3.2.9), i vilket ett uppsamlingsrör innehåller den konjugerade antikroppen.- Aspirera och applicera 500 μL av den filterblockerande lösningen med pipett på 50 kD-kolonnerna med molekylvikt och snurra ner vid 12 000 x g i 2 minuter för att blockera ospecifik antikroppsbindning.
OBS: Om restlösning på toppen av kolonnen är märkbar, vänd upp och ner filtret i uppsamlingsröret och snurra ner vid 3 000 x g i 2 minuter. - Pipettera 50 μg av antikroppen i en volym lösning på 100 μl till filterkolonnen och centrifugera ned vid 12 000 x g i 8 minuter.
OBS: Använd en spektrofotometer för att mäta koncentrationen av den renade antikroppen och för att beräkna volymen lösning motsvarande 50 μg av antikroppen. Om antikroppslösningens volym är mindre än 100 μl, justera volymen till 100 μl genom att tillsätta 1x PBS. Behåll 1 μg okonjugerad antikropp för konjugeringsbekräftelse (steg 4.4). - Pipettera 260 μl reduktionsmastermix (20 μl reduktionslösning 1 blandad med 825 μl reduktionslösning 2, vilket är tillräckligt för tre antikroppskonjugeringsreaktioner) till varje filterkolonn. Virvla försiktigt masterblandningen i 2-3 sekunder, eller pipettera upp och ner för att blanda lösningen med antikroppen. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Efter inkubation, snurra ner filterkolonnerna vid 12 000 x g i 8 minuter. Tillsätt 450 μl konjugeringslösning till filterkolonnerna och snurra ned vid 12 000 x g i 8 minuter.
- Återsuspendera önskad streckkod i 10 μl nukleasfritt vatten och 210 μl konjugeringslösning.
OBS: Förbered en antikroppsetikett omedelbart före användning för färgningen. Återanvänd inte antikroppsstreckkodalikvoter. - Efter avslutad spin-down i steg 3.2.4, tillsätt den återsuspenderade antikroppstaggen (ca 220 μL) i varje motsvarande filterkolonn. Pipettera blandningen försiktigt upp och ner för att blanda reagenserna. Stäng filtrets lock och inkubera konjugeringsreaktionen vid rumstemperatur i 2 timmar. Efter 2 timmar, snurra ner filterkolonnerna vid 12 000 x g i 8 minuter.
OBS: Att lägga 5 μl av den konjugerade lösningen åt sidan i ett polymeraskedjereaktionsrör och förvara den vid 4 °C rekommenderas för bekräftelseprotokollet (se nedan). - Pipettera 450 μL av reningslösningen till varje filterkolonn och snurra ned vid 12 000 x g i 8 minuter. Upprepa tre gånger.
- Överför med pipett 100 μL av lagringslösningen till filterkolonnerna. Pipettera försiktigt blandningen upp och ner mer än 10 gånger och tvätta försiktigt sidorna på filtren i kolonnen.
Lös 50 μg antikropp i 100 μl av lagringslösningen. Om konjugeringsreaktionen startas med mer än 50 μg antikropp, tillsätt mer lagringslösning i detta förhållande. - Invertera filterkolonnerna i ett nytt uppsamlingsrör. Snurra nedåt vid 3 000 x g i 2 minuter vid rumstemperatur. Behåll den uppsamlade lösningen. Pipettera den konjugerade antikroppslösningen till sterila skruvrör och förvara i upp till 1 år vid 4 °C.
OBS: En konjugerad antikropp bör testas med multiplexerad bildteknik efter 2 dagar. Testning före detta kan resultera i hög bakgrundsfärgning.
- Aspirera och applicera 500 μL av den filterblockerande lösningen med pipett på 50 kD-kolonnerna med molekylvikt och snurra ner vid 12 000 x g i 2 minuter för att blockera ospecifik antikroppsbindning.
4. Konjugering bekräftelse
OBS: Innan färgningsexperiment utförs med en användarkonjugerad antikropp med multiplexerad bildteknik bör konjugeringen bekräftas med hjälp av gelelektrofores med 5 μL av den konjugerade antikroppen (se steg 3.2.6) tillsammans med 1 μg av en okonjugerad antikropp (vanligtvis i 2 μL av blandningen) som kontroll. En framgångsrik antikroppskonjugering kommer att demonstreras genom en ökning av antikroppens molekylvikt. Detta bekräftelseprotokoll bedömer dock endast framgången för den kemiska reaktionen för konjugering och tar inte upp antikroppsvalideringen som används för multiplexerad avbildning.
- Pipettera 8 μL och 11 μL nukleasfritt vatten till den reserverade konjugerade antikroppen respektive kontrollera okonjugerade antikroppar för att erhålla en slutlig volym på 13 μl.
- Pipettera 5 μL LDS-provbuffert (eller annat natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforessystem) och 2 μl provreducerande medel i varje prov av den reserverade konjugerade antikroppen och denaturera proverna i ett 95 °C torrt bad i 10 minuter.
- Medan proverna denatureras, späd 40 ml MOPS SDS-körbuffert i 760 ml ultrarent vatten, placera en gel i tanken på ett elektroforessystem och häll den utspädda körbufferten över gelén.
- När denatureringsperioden på 10 minuter är klar, fyll en brunn av gelén med en förfärgad proteinstandard, en med den okonjugerade antikroppen (från steg 3.2.2) och de återstående brunnarna med de konjugerade antikroppsproverna. Kör sedan gelén vid 150 V tills proteinstandarden visas i slutet av gelén.
OBS: Gelén fäster lätt på mikrovågssäkra behållare och kan därför riva, så gelén måste hanteras med försiktighet i följande steg. - När körningen är klar, överför gelén till en mikrovågssäker behållare förfylld med ultrarent vatten och värm den i en mikrovågsugn tills den första bubblan i vattnet visualiseras.
OBS: Tiden för bubblor att bildas varierar mycket beroende på vilken mikrovågsugn som används. - Töm vattnet från behållaren, häll cirka 250 ml Coomassie G-250-fläck över gelén och värm gelén i en mikrovågsugn tills den första bubblan visualiseras. Ta sedan bort behållaren med gelén och Coomassie G-250-fläcken från mikrovågsugnen och lägg den på en shaker i 10 minuter.
- Efter skakning, töm försiktigt fläcken, byt ut den med cirka 200 ml ultrarent vatten och placera sedan behållaren på skakan för att tvätta gelén.
- Töm det ultrarena vattnet och ersätt det med nytt ultrarent vatten fem gånger eller tills resterna av fläcken inte syns i vattenbadet. Låt gelen tvättas över natten på shakern tills band är synliga, om det behövs, innan du fotograferar gelen (figur 1).
OBS: Antikropparna som används vid multiplex avbildning bör ha färgningsmönster som är jämförbara med färgkonjugerade antikroppar. Vävnadssnitt med kända antigener positiva för konjugerade antikroppar kan färgas med oligonukleotidkonjugerade och färgkonjugerade antikroppar. I detta arbete var vävnadsmorfologierna för båda antikroppstyperna ekvivalenta och harmoniserade med varandra, liksom den förväntade cellfördelningen, baserat på biologin hos proteinerna av intresse och testvävnadsproverna. Detta resultat visar effektiviteten av att använda oligonukleotidkonjugerade antikroppsdelar för vävnadsfärgningsbaserade metoder med användning av FFPE-vävnad.
5. Oligonukleotidkonjugerad antikroppsfärgning
- Förbered täckglas för vävnadsplacering.
- Blötlägg täckglasen i en 0,1% poly-L-lysinlösning i 24 timmar vid RT för att förbättra vävnadsvidhäftningen.
- Efter blötläggning, dränera poly-L-lysinlösningen och tvätta täckglasen med ultrarent vatten i 30 sekunder. Upprepa tvätten fyra till sex gånger. Ta bort täckglasen från det ultrarena vattnet som används för tvätt och lägg dem på en luddfri handduk för att torka över natten.
OBS: En histolog måste skära den valda vävnaden i sektioner som är 5 μm tjocka, placera dem på mitten av ett poly-L-lysinladdat täckglas och låt dem torka över natten. Efter torkning skall täckglasen med vävnadssnitt förvaras vid 4 °C i högst 6 månader. Färgningspanelen i detta protokoll innehöll 26 markörer. Vävnaden som användes i detta protokoll var normal mänsklig tonsillvävnad. Täckglasets blötläggningstid bör inte överstiga 1 vecka. Poly-L-lysinbelagda täckglas kan förvaras vid rumstemperatur och måste användas inom 2 månader efter beredning.
- Dagen före färgning, placera täckglashållaren i en ugn på 60 °C över natten.
- Följande dag placeras täckglasprovet i en förvärmd täckglashållare i en ugn på 60 °C. Efter bakning i 30 minuter, kontrollera att paraffinet har smält bort från vävnaden.
- Placera snabbt täckglashållaren/provet i följande lösningsserie: två omgångar avvaxningsmedel i 6 minuter vardera; två omgångar 100% etanol i 5 min vardera; en omgång 90% etanol i 5 min; en omgång 70% etanol i 5 minuter; en omgång 50% etanol i 5 min; en omgång 30% etanol i 5 minuter; och två omgångar dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat ultrarent vatten i 5 minuter vardera.
OBS: Alla utspädningar av etanol bereds med DEPC-behandlat ultrarent vatten. Om xylen används för avvaxning ska den användas i en huva. - När du utsätter följesglashållaren/provet för lösningsserien gör du följande:
- Förbered en fuktkammare genom att placera en tom pipettspetslåda med en vattendränkt pappershandduk i botten.
- Fyll en tryckkokare med tillräckligt med vatten för att halvvägs täcka en 50 ml bägare.
- Placera 5 ml metanol per prov i bägaren vid 4 °C.
- Späd AR9-buffert med DEPC-behandlat ultrarent vatten till 1x; Cirka 50 ml av den utspädda bufferten behövs per täckglashållare.
- När lösningsserien är klar, fyll en 50 ml glasbägare med cirka 40 ml 1x AR9-buffert, sänk ner täckglashållaren / provet i bägaren och täck helt bägaren / täckglashållaren med aluminiumfolie.
- Placera den aluminiumfolietäckta bägaren/täckglashållaren i den vattenfyllda tryckkokaren och koka under högt tryck (ca 15 psi) i 20 minuter.
- Efter tillagning, ta bort bägaren/täckglashållaren, packa försiktigt upp aluminiumfolien och låt bägaren/täckglashållaren svalna vid rumstemperatur i cirka 10 minuter.
- Ta bort täckglashållaren/provet från 1x AR9-bufferten och sänk ner det i två omgångar DEPC-behandlat ultrarent vatten och utför en inkubation av proverna i båda omgångarna i 2 minuter vardera.
- Under inkubationen hämtas hydratiseringsbufferten, blockeringen N, blockeringen av G, blockeringen av J och blockeringen av S-lösningar samt antikroppsspädningsvätskan/blocket från den multiplexerade bildfärgningssatsen. För två täckglasprover, märk 6-brunnsplattor för lösningarna med hjälp av de konfigurationer som visas i figur 2.
- Placera täckglasprovet i två omgångar om 5 ml hydratiseringsbuffert i vardera 2 minuter.
- Efter båda omgångarna av placering i hydratiseringsbufferten, placera täckglasprovet i 5 ml av det multiplexerade avbildande antikroppsspädningsmedlet / blocket och inkubera i 20-30 minuter vid RT (överskrid inte 30 min).
- Under inkubationen, förbered en antikroppscocktail genom att göra en 200 μL masterblandning av multiplexerade avbildande antikroppsspädningsmedel / block, N-blockerare, G-blockerare, J-blockerare och S-blockerlösningar.
OBS: Beräkna den totala antikroppsmängden baserat på antalet markörer och varje markörs validerade titrering och subtrahera den totala antikroppsmängden från masterblandningen. Till exempel, för sex markörer, var och en med en titrering på 1: 200, skulle ekvationen vara 200 μL mastermix - 6 μL antikroppscocktail = 194 μL masterblandning.
- Efter inkubation i det multiplexerade avbildande antikroppsspädningsmedlet/blocket, placera täckglasprovet i fuktkammaren som förberetts i steg 5.5.1, pipettera 190 μL av antikroppscocktailen på täckglasprovet och inkubera täckglasprovet vid rumstemperatur i 3 timmar.
- Efter inkubation, tvätta täckglasprovet i två omgångar med 5 ml av det multiplexerade avbildande antikroppsspädningsmedlet/blocket i 2 minuter vardera.
- För att fixera de bundna antikropparna mot vävnaden på täckglaset, utför steg 5.7.3-5.7.5 i fuktighetskammaren.
- Inkubera täckglasen i 10 minuter med 16% formaldehyd utspädd till 1,6% med lagringslösning och tvätta sedan täckglasen tre gånger med 1x PBS.
- Inkubera täckglasen i 5 minuter med 4 °C metanol och tvätta sedan täckglasen tre gånger med 1x PBS.
- Inkubera täckglasen i 20 minuter med 5 ml fixeringsreagens utspätt med 1x PBS och tvätta sedan täckglasen tre gånger med 1x PBS.
- Förvara de färgade täckglasproverna i lagringsbufferten vid 4 °C i upp till 2 veckor
6. Multiplexerad bildreporterplatta
OBS: En 96-brunnsplatta, kallad en reporterplatta, som innehåller streckkodade fluoroforer i enskilda brunnar framställs enligt specialdesignade multiplexerade avbildningsexperiment och korrelerar med varje färgat täckglasprov. Följande steg är för förberedelse av rapportskylten.
- Bered en rapportmastermix genom att kombinera 4 880 μL nukleasfritt vatten, 600 μL 10x multiplexerad bildbuffert, 500 μL analysreagens och 20 μL kärnfläcklösning. Detta kommer att räcka för 20 cykler av alla brunnar.
- I varje cykel av det specialdesignade multiplexerade avbildningsexperimentet fylls en brunn med 245 μL av en lösning som innehåller rapportmasterblandningen och de specifika streckkodade fluoroforerna för den cykeln.
OBS: Se figur 3 för rapportskyltkonfigurationen som används i detta protokoll för en karcinompanel. - För att skydda de streckkodade fluoroforerna, fäst ett folieplåtskydd över reporterplattan och placera plattan i det multiplexerade bildinstrumentet.
- Förvara reporterplattan i en mörk låda vid 4 °C i upp till 2 veckor.
7. Kalibrera och köra den multiplexerade bildmaskinen
OBS: Det högupplösta fluorescensmikroskopet fångar fyra olika fluorescenskanaler i varje multiplexerad bildcykel vid 20x, 100% excitationsljus och med låg fotoblekning.
- Kalibrera bildtagningens fokus med hjälp av DAPI-kanalen genom att placera ett provtäckglas på mikroskopsteget, manuellt pipettera 700 μL av en 1:1 500 titrering av kärnfläckslösning på vävnaden.
OBS: Täckglaset hålls kvar på mikroskopsteget under provtvättningen och avbildningen. - För att förbereda det multiplexerade bildinstrumentet, späd 10x multiplexerad bildbuffert till 1x med DEPC-behandlat ultrarent vatten och fyll reagensflaskor med lämpliga lösningar / lösningsmedel, inklusive den utspädda 1x multiplexerade bildbufferten, DEPC-behandlat ultrarent vatten och dimetylsulfoxid (DMSO).
- När reagensflaskorna har fyllts på lämpligt sätt, ange experimentell design i programvaran för multiplexerad bildinstrumenthantering; ange rätt cykel, brunnsnummer, z-stackplatser, markörnamn, klass och exponeringstid för varje cykel (figur 4), ställa in alla mikroskopparametrar; och välj de intressanta områdena på provomslaget som ska avbildas.
- Klicka på knappen Experiment i styrprogramvaran (bild 4A). I fönstret Experimentkonfiguration och hantering klickar du på knappen Ny mall (bild 4B).
- Skriv projektnamnet i utrymmet bredvid knappen Projekt (bild 4C). Skriv eller välj det totala antalet cykler (bild 4D).
- Klicka på knappen Kanaltilldelning , skriv in informationen för varje cykel i kolumnerna (bild 4E) och klicka på knappen Spara mall . Starta experimentet genom att klicka på knappen Starta experiment .
OBS: Under ett multiplexerat avbildningsexperiment hämtar instrumentet de streckkodade fluoroforerna från en brunn på reporterplattan (högst fyra fluoroforer per brunn, inklusive DAPI), dispenserar dem direkt på provtäcket och avbildar de intressanta områdena för varje fluorescenskanal. Efter all avbildning för den cykeln tvättar instrumentet bort de streckkodade fluoroforerna och avger nästa cykel av reportrar (från nästa brunn på reporterplattan). Avbildningen fortsätter tills alla cykler med 26 markörer har slutförts.
8. Bildinsamling
OBS: Multiplexerade bilder kan samlas in med hjälp av alla anpassade inverterade fluorescensmikroskop konfigurerade med fyra fluorescenskanaler (DAPI, Cy3, Cy5 och Cy7) och utrustade med en Plan Fluor 20x-lins. Avbildning och tvättning av täckglasproverna utförs iterativt automatiskt med hjälp av en specialutvecklad fluidikuppsättning. Bilderna förvärvas med hjälp av processorprogramvara (v1.8.0.7) i QPTIFF-format.
- I processorfönstret klickar du på knappen Input och väljer experimentnamnet.
- I avsnittet Bearbetningsalternativ väljer och markerar du Bakgrundssubtraktion, Dekonvolution, Utökat skärpedjup och Skuggningskorrigering. Klicka på Start-knappen .
9. Bildanalys
OBS: De förvärvade bilderna kan laddas upp till en patenterad automatiserad bildanalysprogramvara eller programvara med öppen källkod (figur 5) för nedströmsanalys.
- Klicka på QuPath-ikonen på datorn och öppna programvaran. Dra QPTIFF-filen till visningsfönstret .
- Klicka på knappen Ljusstyrka och kontrast, som öppnar fönstret Ljusstyrka och kontrast. Markera eller avmarkera markören i kolumnen Markerad för att visa eller stänga markörsignalen.
- Klicka på knappen Zooma för att passa för att zooma in eller ut ur intresseområdet.
OBS: Multiplexerad bilddatavisualisering ger användaren en djup titt på vävnadens mikromiljö. Individuella markörer i FFPE-prover kan visualiseras i fluorescensformat (figur 6 och figur 7) eller i patologivy. Flera beräkningsplattformar kan användas för att bearbeta de sammansatta bilderna och analysera multiplexerade vävnadsbilddata. Med hjälp av denna programvara kan rumslig fenotypning, såväl som sällsynt cellupptäckt och cellområdesberäkning, åstadkommas med helbildsbilder av ultrahög multiplexerad vävnad genererad via multiplexerad bildteknik. Se figur 6 för de 26 antikropparna i karcinompanelen och tonsillprovet (kompletterande figur 1).
Representative Results
Vi använde FFPE-tonsillprover för att utveckla en 26-markörs immunonkologipanel för att illustrera immunstatusen hos FFPE-vävnad med hjälp av ett streckkodande bildanalyssystem. Totalt används för närvarande 19 antikroppar i andra multiplexerade avbildningsstudier i vårt labb. Alla markörer har testats med FFPE-vävnad med kromogen IHC. Alla antikroppar konjugerades till unika DNA-oligonukleotider. När täckglasen ställs in med hjälp av den webbaserade instrumenthanteraren (figur 4) för denna streckkodsbildanalysteknik bör det noteras att den första och sista cykeln alltid är "tomma" (figur 2 och figur 4), vilket ger bakgrundsfluorescenssignalerna som ska subtraheras från de specifika signalerna från antikropparna. Efter att bilder i QPTIFF-format har samlats in med fluorescensmikroskopet kan de visualiseras med hjälp av flera patenterade automatiserade bildanalysprogram eller program med öppen källkod. Sammansatta bilder kan visa alla markörer eller valda markörer för en bättre bild av signalerna (figur 5). Dessutom kan varje antikropp utvärderas visuellt för nukleär, cytoplasmatisk eller membranös lokalisering. Immun-, tumör- och stromaceller kan lätt identifieras. Därefter kan bildanalys ge information om signalintensitet, dynamiskt omfång och rumslig fördelning av alla markörer (figur 6). Denna teknik gjorde det möjligt för oss att analysera alla 26 markörer på subcellulär nivå i en enda vävnadssektion (figur 7). Genom att analysera markörernas samlokalisering kunde vi identifiera de cellulära fenotyperna, lokalisera den rumsliga cellpositionen, beräkna avståndet mellan celler och hitta fördelningen av cellerna. Den avgörande effekten av denna teknik är presentationen av en robust 26-markörpanel med fokus på vävnadsmikromiljöns immunstatus.
Figur 1: Bild av anpassad konjugerad antikroppsvalidering med användning av en Bis-Tris-proteingel. Lane 1 i gelen visar proteinstandarden. Bana 2 och bana 4 visar streckkodskonjugerade antikroppar (pilar). Lane 3 och Lane 5 visar de tunga och lätta kedjebanden från en okonjugerad antikropp (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konfigurationskarta för färgningsplatta för två täckglasprover. Förkortningar: HB = hydratiseringsbuffert; B = antikroppsspädningsmedel/block; PSFS = fixeringslösning efter färgning, PBS = fosfatbuffrad saltlösning; MeOH = metanol; S = lagringslösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Konfiguration av rapportskylt. Varje konjugerad antikropp har en streckkod som kompletterar en specifik reporter. För att ställa in rapportplattan bör varje konjugerad antikropp och dess motsvarande rapportör listas. Därefter tilldelas varje antikropp ett cykelnummer. Prestandan hos två blankcykler (C1 och C18) används för att utvärdera nivån av autofluorescens i de tre fluorescenskanalerna och för bakgrundssubtraktion efter avbildning med hjälp av programvaran för bildinsamlingskontroll. En programvaruguide kontrollerar instrumentet i detta skede för att säkerställa att alla inställningar är korrekta (bild 4). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Bildinsamling med hjälp av kontrollprogramvaran för experimentinstallationen. (A) Välj fliken Experiment i det nedre vänstra hörnet av styrprogramvaran för att förbereda och starta installationen. (B,C) Välj Ny mall för att ange experimentinställningarna med ett nytt projekt- och experimentnamn. (D) Ändra startcykelbrunnen och antalet cykler för att återspegla reporterns plats på rapportskylten med 96 brunnar. (E) Tilldela rätt fluorescenskanaler till de fyra kanaler som är avsedda för försökskörningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Bildvisualisering med webbaserad programvara (QuPath). Visningsfönstret visar 26 markörer i FFPE-sektionen för färgad tonsillvävnad. I fönstret Ljusstyrka och kontrast visas markörerna med bockmarkeringarna. Slutligen visar visningsfönstret FFPE-exemplet med de valda markörerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bildvisualisering med webbaserad programvara. (A) Tonsillvävnadssnitt färgades för de 26 markörerna och bilderna av sektionerna i QPTIFF-format visualiserades med hjälp av kommersiell digital bildvisningsprogramvara eller programvara med öppen källkod (QuPath) för anteckningar och granskning. (B-F) Sex markörer visades i samma anteckning för en bättre bild av signalerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Visningar av de 26 enskilda markörer som används med webbaserad programvara. Marköruttrycket i tonsillvävnaden visas via immunofluorescensfärgning med en immunonkologipanel (överst till vänster). Enskilda markörer i två små områden (röda rektanglar) visas. Den inzoomade infogningen visar celler som är positiva för dessa markörer (vita pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 8: Sammanfattning av arbetsflödet för multiplexerad bildinsamling. FFPE-vävnadssektioner färgades med hjälp av 26-antikroppspanelen följt av en flercykelreaktion. Råbilder av de färgade sektionerna bearbetades beräkningsmässigt och en celldensitet och rumslig analys utfördes med hjälp av de sammansatta bilderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: IHC-validering i tonsillvävnad. FFPE-vävnadssektioner färgades med användning av en individuell antikropp. Marköruttrycket i tonsillvävnaden visas med låg förstoring och den inzoomade insatsen visar celler som är positiva för markören (röda rektanglar). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
TME spelar en viktig roll för cancerutveckling, progression och behandlingssvar. Dessutom kan tätheten hos specifika tumörinfiltrerande lymfocytundergrupper i TME fungera som en prognostisk biomarkör för vissa typer av cancer. Anmärkningsvärt är att utöver TME:s cellulära sammansättning kan de rumsliga egenskaperna hos en tumör ge en översikt för att förstå tumörens biologi och identifiera potentiella prognostiska biomarkörer12,17.
Eftersom många immuncellspopulationer är involverade i procancer- eller anticancersvar, kommer en bättre förståelse av dessa celler och deras rumsliga relationer med varandra och med cancerceller att hjälpa till att identifiera nya immunterapeutiska strategier. Tidigare studier har stratifierat lokalisering och rumslig fördelning av TME-celler baserat på vävnadsstrukturen i de intratumorala och peritumorala områdena och tumörcellernas invasiva marginaler18,19. Under de senaste 15 åren har tekniska framsteg gjort fenotypisk analys av enskilda celler baserat på deras rumsliga spridning till ett nytt, inflytelserikt verktyg för att studera TME och kategorisera potentiella biomarkörer för tumörimmunterapi. Multiplex IF-histokemi kan samtidigt uppskatta flera biologiska markörer20.
I likhet med strategin för oligonukleotidkonjugerade antikroppar används fyra typer av proteinbaserade multiplexplattformar för att studera TME: kromogen-, fluorescens-, DNA-streckkods- och metallisotopmärkta antikroppsdetektionssystem. De kostnadseffektiva kromogena IHC-plattformarna möjliggör helbildsvisualisering och patologisk bedömning genom att använda konventionell ljusfältsmikroskopi. I multiplexerad IF och IHC används antikroppar konjugerade med fluoroforer. Multiplex IF/IHC-plattformen detekterar antikroppar med hög specificitet och kan kvantifiera riktade antikroppar även på subcellulär nivå 6,21. Dessutom, på grund av kromogens och fluoroforers natur, kan användningen av en antikroppspanel fånga uttrycket av upp till 10 biomarkörer på en enda bild. På metallisotopbaserade plattformar används metalltaggade antikroppar för att utföra multiplexerad avbildning med encells- och rumsupplösning och hög känslighet för enskilda vävnadssnitt22. Teoretiskt möjliggör dessa metallkonjugerade antikroppsmetoder samtidig detektion av mer än 100 biomarkörer på en enda vävnadssektion. En utmaning med isotopmärkningstekniken är isobarisk interferens, vilket förhindrar att 100% renhet av anrikning uppnås23. Dessutom ökar interferensen när antalet markörer ökar. DNA-konjugerade antikroppsdetektionsplattformar känner igen antikroppar märkta med unika DNA-streckkoder. Mer än 40 biomarkörer kan fångas samtidigt med hög specificitet på dessa plattformar6.
Multiplexed imaging är en kommersiellt tillgänglig DNA-streckkodsmärkt antikroppsdetektionsplattform för applicering av DNA-konjugerade antikroppar på ett enda vävnadsglas i ett steg (figur 8). För vävnadsberedningssteget, till skillnad från den multiplexerade jonstråleavbildningsplattformen, som kräver användning av guldbelagda glas erhållna från tillverkare, kräver den multiplexerade bildplattformen endast regelbundna täckglas eller glas belagda med 0,1% poly-L-lysin för att hjälpa vävnaden att fästa vid den och hålla vävnaden intakt under färgnings- och avbildningsprocessen. Användning av vävnadssnitt på täckglas inom 4 veckor efter snittning rekommenderas, eftersom långvarig lagring av ofärgade objektglas resulterar i minskning av antigeniciteten. Ett färgat täckglasprov kan förvaras i en buffert vid 4 °C i upp till 2 veckor utan att färgningssignalen går förlorad. Ingen särskild utrustning krävs för förvaring av täckglasproverna. Det multiplexerade bildsystemet har uppgraderats för att använda vanliga glas istället för täckglas, vilket möjliggör färgning av större vävnader och enkel hantering. Vid användning av en reduktionslösning för antikroppskonjugering (steg 3.2.3) ska reaktionen begränsas till högst 30 minuter för att förhindra skador på antikroppar. Blockeringsbuffertarna i steg 5.6.6 bör vara nyligen förberedda och blockeringsbuffertarna får inte återanvändas.
Jämfört med kromogen-, fluorescens- och metallisotopmärkta multiplexa antikroppsdetekteringsplattformar har den multiplexerade bildtekniken vissa fördelar. Till exempel finns mer än 60 fördesignade antikroppspaneler för multiplexerad avbildning kommersiellt tillgängliga, vilket hjälper till att spara tid och kostnader vid antikroppskonjugering och validering, och antalet fördesignade antikroppspaneler växer. Dessa antikroppar, som inkluderar karcinommarkören pan-cytokeratin, melanommarkören SOX10, den vaskulära markören CD31, stromamarkören SMA och många immuncellmarkörer, är validerade och experimentklara. För antikroppar som inte är fördesignade är det kommersiellt tillgängliga konjugeringskitet som är utformat för användning med multiplexerad avbildning enkelt och användarvänligt. Kundkonjugerade antikroppar är bra i 1 år vid förvaring vid 4 °C. Dessutom krävs ingen maskinuppvärmning för att ta bilderna. I denna multiplexerade bildteknik resulterar de iterativa tvätt-, hybridiserings- och strippningsstegen i bildförvärvet sällan i minskad markörintensitet eller försämrad vävnadsmorfologi 5,24,25. Dessutom fångas sammansatta bilder i QPTIFF-format med ett enkelt trefärgs fluorescensmikroskop och kan laddas upp och analyseras med hjälp av digital analysprogramvara från tredje part. Färgningsmarkörerna kan visualiseras med encellsupplösning, och cellfenotyper kan karakteriseras via samlokalisering av markörerna (figur 6 och figur 7). Den omfattande analysen av en multiplexerad bild avslöjar vidare vävnadsfack, encellsmarkörkvantifiering och närmaste granne och närhetsdata (figur 8).
En utmaning i multiplexerad bildanalys är celltypsidentifiering. Vanligtvis, när fler klassificerare med ett objekt tillämpas på en bild, kommenteras mer ovanliga fenotyper. Därför rekommenderas att använda kända markörer som inte uttrycks samtidigt i samma klassificerare och endast använda den fenotyprelaterade klassificeraren för annotering av enskilda celler. Variationer i celltypsannotering kommer att resultera i väsentligt olika rumsliga resultat, såsom skillnader i cellrumslig fördelning och cellulär grannskapsanalys26,27.
Multiplexerad bildanalys har visat sig vara framgångsrik vid färgning och avbildning av många provtyper, inklusive FFPE-vävnad, färsk frusen vävnad, arkiverade hela bilder och vävnadsmikroarrayer. Multiplexerade bilder av bröst, hjärna, lunga, mjälte, njure, lymfkörtel och hudvävnadssektioner kan förvärvas med djupa encelliga rumsliga fenotypdata 5,16,25,28.
I framtiden förväntas fler fördesignade antikroppar för multiplexerad avbildning. Dessutom behövs utveckling av specifik programvara för multiplexerad bildanalys. För närvarande finns många kommersiellt tillgängliga program med öppen källkod för Hi-Plex-bildanalys29, men forskare behöver fortfarande hjälp med att skapa ett standardarbetsflöde för dessa analyser30,31. Även om de sammansatta bilderna som tagits med detta protokoll är kompatibla med programvara från tredje part kan detta leda till extra kostnader för användaren. En annan nackdel med den multiplexerade bildtekniken är signalreduktionen i kärnproteindetektering efter iterativ tvättning, hybridisering och strippning med stora paneler av antikroppar. Lyckligtvis kan detta minimeras genom att hämta de streckkodade fluoroforerna vid tidiga cykler vid utformningen av reporterplattorna. Nyligen uppgraderades denna plattform med ett nytt höghastighetsskanningssystem, vilket dramatiskt har minskat tiden för att få sammansatta bilder32. Dessutom har en ny strategi som använder tyramidkonjugerade streckkoder rapporterats förbättra oligonukleotidkonjugerad antikroppsstreckkodningsbaserad avbildning. Denna teknik syftar till att förstärka färgningssignaler för vilka streckkodskonjugerade antikroppar är svåra att erhålla33.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Donald R. Norwood från Editing Services, Research Medical Library vid MD Anderson för redigering av denna artikel och multiplex IF- och bildanalyslaboratoriet vid Institutionen för translationell molekylär patologi vid MD Anderson. Detta projekt stöddes delvis av Translational Molecular Pathology-Immunoprofiling laboratory (TMP-IL) Moonshots Platform vid Institutionen för translationell molekylär patologi, University of Texas MD Anderson Cancer Center och NCI Cooperative Agreement U24CA224285 (till MD Anderson Cancer Center CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x AR9 Buffer | Akoya Biosciences | AR900250ML | |
| 10x Buffer | Akoya Biosciences | 7000001 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28906 | |
| 1X Antibody Diluent/Block | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| Antibody Conjugation Kit | Akoya Biosciences | 7000009 | Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution |
| Assay Reagent | Akoya Biosciences | 7000002 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | 40718-25ML | |
| Dimethyl sulfoxide | Avantor/VWR | BDH1115-4LP | |
| Ethanol, 200 proof | |||
| G Blocker V2 | Akoya Biosciences | 240199 | |
| Histoclear | Thermo Fisher Scientific | 50-329-50 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Milli-Q Integral 10 | Millipore | ZRXQ010WW | |
| Niknon Fluorescence microscope | Keyence Corp. of America | BZ-X810 | |
| Nuclear Stain | Akoya Biosciences | 7000003 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| NuPAGE | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination | Akoya Biosciences | 5450004 (BX025/RX025) | |
| 5450003 (BX022/RX022) | |||
| 5450023 (BX002/RX002) | |||
| 5250002 (BX020/RX020) | |||
| 2520003 (BX023/RX023) | |||
| 5250005 (BX029/RX029) | |||
| 5250007 (BX035/RX035) | |||
| 5250012 (BX052/RX052) | |||
| 5550012 (BX030/RX030) | |||
| 5550015 (BX042/RX042) | |||
| 5550014 (BX036/RX036) | |||
| QuPath | Open-Source | https://qupath.github.io/ | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6065 | |
| Staining Kit | (Akoya Biosciences | 7000008 | Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Labani-Motlagh, A., Ashja-Mahdavi, M., Loskog, A. The tumor microenvironment: A milieu hindering and obstructing antitumor immune responses. Frontiers in Immunology. 11, 940 (2020).
- Jin, M. Z., Jin, W. L. The updated landscape of tumor microenvironment and drug repurposing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 166 (2020).
- Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: From T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
- Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nature Protocols. 16 (8), 3802-3835 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Eng, J., et al. A framework for multiplex imaging optimization and reproducible analysis. Communications Biology. 5 (1), 438 (2022).
- Taube, J. M., et al. Multi-institutional TSA-amplified multiplexed immunofluorescence reproducibility evaluation (MITRE) study. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e002197 (2021).
- Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
- Heindl, A., Nawaz, S., Yuan, Y. Mapping spatial heterogeneity in the tumor microenvironment: A new era for digital pathology. Laboratory Investigation. 95 (4), 377-384 (2015).
- Kuswanto, W., Nolan, G., Lu, G. Highly multiplexed spatial profiling with CODEX: bioinformatic analysis and application in human disease. Seminars in Immunopathology. 45 (1), 145-157 (2022).
- Phillips, D., et al. Immune cell topography predicts response to PD-1 blockade in cutaneous T cell lymphoma. Nature Communications. 12 (1), 6726 (2021).
- Jhaveri, N., et al. Deep ultrahigh-plex spatial phenotyping of human cancer tissues. Cancer Research. 82, 3877 (2022).
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Yuan, Y.
- Bruck, O., et al. Spatial immunoprofiling of the intratumoral and peritumoral tissue of renal cell carcinoma patients. Modern Pathology. 34 (12), 2229-2241 (2021).
- Tsujikawa, T., et al. Prognostic significance of spatial immune profiles in human solid cancers. Cancer Science. 111 (10), 3426-3434 (2020).
- Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 674747 (2021).
- Parra, E. R., et al. Identification of distinct immune landscapes using an automated nine-color multiplex immunofluorescence staining panel and image analysis in paraffin tumor tissues. Scientific Reports. 11 (1), 4530 (2021).
- Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Frontiers in Immunology. 12, 666233 (2021).
- Campos Clemente, L., Shi, O., Rojas, F., Parra, E. R. Expanding the comprehension of the tumor microenvironment using mass spectrometry imaging of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64015 (2022).
- Schurch, C. M., et al. Coordinated cellular neighborhoods orchestrate antitumoral immunity at the colorectal cancer invasive front. Cell. 182 (5), 1341-1359 (2020).
- Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by CODEX tissue imaging. Frontiers in Immunology. 12, 687673 (2021).
- Hickey, J. W., Tan, Y., Nolan, G. P., Goltsev, Y. Strategies for accurate cell type identification in CODEX multiplexed imaging data. Frontiers in Immunology. 12, 727626 (2021).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999 (2022).
- Francisco-Cruz, A., Parra, E. R., Tetzlaff, M. T. Wistuba, II. Multiplex immunofluorescence assays. Methods in Molecular Biology. 2055, 467-495 (2020).
- Shakya, R., Nguyen, T. H., Waterhouse, N., Khanna, R. Immune contexture analysis in immuno-oncology: applications and challenges of multiplex fluorescent immunohistochemistry. Clinical and Translational Immunology. 9 (10), e1183 (2020).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- DeRosa, J. Setting a new standard for spatial omics: An integrated multiomics approach: every single cell, two different analytes, one unbiased picture. Genetic Engineering & Biotechnology News. 42, 26-28 (2022).
- Simonson, P. D., Valencia, I., Patel, S. S. Tyramide-conjugated DNA barcodes enable signal amplification for multiparametric CODEX imaging. Communications Biology. 5 (1), 627 (2022).
