עכבר ב- Vivo שליה ממוקד מניפולציה CRISPR
Summary
כאן אנו מתארים שיטה ספציפית לזמן כדי לתפעל ביעילות מסלולים התפתחותיים קריטיים בשליית העכבר in vivo. זה מבוצע באמצעות הזרקה ואלקטרופורציה של פלסמידים CRISPR לתוך השליות של סכרים בהריון ביום העוברי 12.5.
Abstract
השליה היא איבר חיוני המווסת ומשמר את התפתחות היונקים ברחם. השליה אחראית על העברת חומרי מזון ופסולת בין האם לעובר ועל ייצור ואספקה של גורמי גדילה והורמונים. מניפולציות גנטיות שליה בעכברים הן קריטיות להבנת התפקיד הספציפי של השליה בהתפתחות טרום לידתי. לעכברים טרנסגניים בעלי ביטוי Cre ספציפי לשליה יש יעילות משתנה, ושיטות אחרות למניפולציה של גנים שליה יכולות להיות חלופות שימושיות. מאמר זה מתאר טכניקה לשינוי ישיר של ביטוי גנים שליה באמצעות מניפולציה של גן CRISPR, אשר ניתן להשתמש בה כדי לשנות את הביטוי של גנים ממוקדים. באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, סכרים בהריון עוברים לפרוטומיה ביום העוברי 12.5 (E12.5), ופלסמיד CRISPR מועבר על ידי מיקרופיפטה זכוכית לתוך השליה הבודדת. הפלסמיד מחושמל מיד לאחר כל הזרקה. לאחר התאוששות הסכר, השליות והעוברים יכולים להמשיך בהתפתחות עד להערכה בנקודת זמן מאוחרת יותר. הערכת השליה והצאצאים לאחר השימוש בטכניקה זו יכולה לקבוע את התפקיד של תפקוד השליה הספציפי לזמן בהתפתחות. סוג זה של מניפולציה יאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו גנטיקה ותפקוד של שליה משפיעים על גדילת העובר והתפתחותו בהקשרים של מחלות מרובות.
Introduction
השליה היא איבר חיוני המעורב בהתפתחות העובר. תפקידה העיקרי של השליה הוא לספק גורמים חיוניים ולווסת את העברת החומרים המזינים והפסולת אל העובר וממנו. שליות יונקים מורכבות הן מרקמה עוברית והן מרקמה אימהית, המרכיבות את הממשק העוברי-אימהי, ולכן הגנטיקה של האם והעובר משפיעה על הפונקציה1. אנומליות גנטיות או תפקוד לקוי של השליה יכולים לשנות באופן דרסטי את התפתחות העובר. עבודות קודמות הראו כי גנטיקה והתפתחות שליה קשורות להתפתחות משתנה של מערכות איברים ספציפיות בעובר. בפרט, הפרעות בשליה קשורות לשינויים במוח, בלב ובמערכת כלי הדם של העובר 2,3,4,5.
העברת הורמונים, גורמי גדילה ומולקולות אחרות מהשליה לעובר ממלאת תפקיד מרכזי בהתפתחות העובר6. הוכח כי שינוי ייצור השליה של מולקולות ספציפיות יכול לשנות את ההתפתחות העצבית. דלקת אימהית יכולה להגביר את ייצור הסרוטונין על ידי שינוי ביטוי הגן המטבולי טריפטופן (TRP) בשליה, אשר לאחר מכן יוצר הצטברות של סרוטונין במוח העובר7. מחקרים אחרים מצאו מומים בשליה לצד מומי לב. הפרעות בשליה נחשבות כתורמות למומי לב מולדים, המום המולד, השכיח ביותר בבני אדם8. מחקר שנערך לאחרונה זיהה מספר גנים בעלי מסלולים תאיים דומים הן בשליה והן בלב. אם הם משובשים, מסלולים אלה עלולים לגרום לפגמים בשני האיברים9. המומים בשליה עלולים להחמיר מומי לב מולדים. תפקידה של גנטיקה של השליה ותפקודה על התפתחות מערכת איברים עוברית ספציפית הוא תחום מחקר מתפתח.
לעכברים יש שליות המוכריאליות ותכונות אחרות של שליות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים שימושיים ביותר לחקר מחלות אנושיות1. למרות חשיבותה של השליה, חסרות כיום מניפולציות גנטיות ממוקדות in vivo. יתר על כן, יש כיום יותר אפשרויות זמינות עבור נוקאאוטים או נוק-דאונים מאשר ביטוי יתר או מניפולציות רווח של פונקציה בשליה10. ישנם מספר קווים טרנסגניים למניפולציה ספציפית לשליה, כל אחד בשושלות טרופובלסטים שונות בנקודות זמן שונות. אלה כוללים Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ו- Gcm1-Cre 11,12,13,14. בעוד טרנסגנים Cre אלה יעילים, הם עשויים שלא להיות מסוגלים לתפעל גנים מסוימים בנקודות זמן ספציפיות. שיטה נפוצה נוספת לביטוי גנים של שליה היא החדרת וקטורים לנטי-ויראליים לתרבית בלסטוציסט, מה שגורם למניפולציה גנטית ספציפית לטרופובלסט15,16. טכניקה זו מאפשרת שינוי משמעותי בביטוי גן השליה בשלב מוקדם בהתפתחות. השימוש בהפרעות RNA in vivo נוצל בדלילות בשליה. החדרת פלסמידים shRNA יכולה להתבצע באופן דומה לטכניקת CRIPSR המתוארת במאמר זה. זה נעשה ב E13.5 כדי להפחית בהצלחה את ביטוי PlGF בשליה, עם השפעות על כלי הדם במוח של צאצאים17.
בנוסף לטכניקות המשמשות בעיקר לנוקאאוט או להדחה, גרימת ביטוי יתר מבוצעת בדרך כלל עם אדנווירוסים או החדרת חלבון אקסוגני. לטכניקות המשמשות לביטוי יתר יש שיעורי הצלחה משתנים והן בוצעו לרוב בשלב מאוחר יותר בהריון. כדי לחקור את תפקידו של גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) בתפקוד השליה, בוצעה העברת גן שליה בתיווך אדנובירל כדי לגרום לביטוי יתר של הגן IGF-1 18,19. זה בוצע מאוחר בהריון עכבר על E18.5 באמצעות הזרקת שליה ישירה. כדי לספק אפשרויות נוספות ולעקוף כשלים אפשריים של מניפולציות גנטיות מבוססות של שליה, כגון כשלים משולבים של Cre-Lox, הרעילות האפשרית של אדנווירוסים, וההשפעות מחוץ למטרה של shRNA, ניתן להשתמש במניפולציה ישירה של CRISPR in vivo של השליה 20,21,22. מודל זה פותח כדי לתת מענה להיעדר מודלים של ביטוי יתר וליצור מודל עם גמישות.
טכניקה זו מבוססת על עבודתם של Lecuyer et al., שבה פלסמידים shRNA ו- CRISPR כוונו ישירות in vivo לשליות עכבר כדי לשנות ביטוי PlGF 17. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לשנות ישירות את ביטוי גני השליה באמצעות מניפולציה של CRISPR במספר נקודות זמן; עבור עבודה זו, E12.5 נבחר. השליה התבגרה בשלב זה והיא גדולה מספיק כדי לבצע מניפולציות, מה שמאפשר החדרת פלסמיד CRISPR ספציפי על E12.5, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר מאמצע עד סוף ההריון23,24. בניגוד לגישות טרנסגניות, אך בדומה להשראות נגיפיות או הפרעות RNA, טכניקה זו מאפשרת ביטוי יתר או נוקאאוט בנקודות זמן מסוימות באמצעות גישה כירורגית מתקדמת יחסית, ובכך מונעת שליה לקויה אפשרית או קטלניות עוברית משינויים מוקדמים יותר. מכיוון שרק שליות מעטות מקבלות את פלסמיד הניסוי או הבקרה בתוך המלטה, הגישה מאפשרת שני סוגים של בקרות פנימיות. בקרות אלה הן אלה המוזרקות ומתחשמלות עם פלסמיד הבקרה המתאים ואלה שאינן מקבלות מניפולציה ישירה. טכניקה זו הותאמה ליצירת ביטוי יתר של הגן IGF-1 בשליית העכבר באמצעות פלסמיד CRISPR מתווך הפעלה סינרגיסטי (SAM). הגן IGF-1 נבחר, שכן IGF-1 הוא הורמון גדילה חיוני המועבר לעובר ומיוצר בעיקר בשליה לפני הלידה25,26. טכניקת CRISPR חדשה ממוקדת שליה זו תאפשר מניפולציה ישירה שתסייע להגדיר את הקשר בין תפקוד השליה להתפתחות העובר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השליה היא מווסת עיקרי של גדילת העובר, וכאמור, שינויים בביטוי או בתפקוד של גן השליה עשויים להשפיע באופן משמעותי על התפתחות העובר6. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן לביצוע מניפולציה ממוקדת in vivo CRISPR של שליית העכבר בגישה כירורגית מתקדמת יחסית. טכניקה זו מאפשרת יבול משמעותי ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים במקורות המימון הבאים: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ו-NIH T32GM145441. המחברים מודים לד”ר ואל שפילד ולמעבדות של ד”ר קלווין קרטר באוניברסיטת איווה על השימוש בחדר הניתוח ובציוד שלהם, כמו גם לד”ר אריק ואן אוטרלו, ד”ר ננדקומר נאראיאנן וד”ר מתיו ובר על עזרתם במיקרוסקופיה. המחברים מודים גם לד”ר שרה מאורר, מאיה אוונס וסרילקה קונדו על עזרתן בניתוחי הפיילוט.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
