Manipulación CRISPR placentaria dirigida a ratones en vivo
Summary
Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.
Abstract
La placenta es un órgano esencial que regula y mantiene el desarrollo de los mamíferos en el útero. La placenta es responsable de la transferencia de nutrientes y desechos entre la madre y el feto y la producción y entrega de factores de crecimiento y hormonas. Las manipulaciones genéticas placentarias en ratones son fundamentales para comprender el papel específico de la placenta en el desarrollo prenatal. Los ratones transgénicos que expresan Cre específicos de la placenta tienen una efectividad variable, y otros métodos para la manipulación de genes placentarios pueden ser alternativas útiles. Este documento describe una técnica para alterar directamente la expresión génica placentaria utilizando la manipulación del gen CRISPR, que se puede utilizar para modificar la expresión de genes específicos. Utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, las madres embarazadas se someten a una laparotomía en el día embrionario 12.5 (E12.5), y un plásmido CRISPR se administra mediante una micropipeta de vidrio en las placentas individuales. El plásmido se electropora inmediatamente después de cada inyección. Después de la recuperación de la madre, las placentas y los embriones pueden continuar el desarrollo hasta la evaluación en un momento posterior. La evaluación de la placenta y la descendencia después del uso de esta técnica puede determinar el papel de la función placentaria específica en el tiempo en el desarrollo. Este tipo de manipulación permitirá una mejor comprensión de cómo la genética placentaria y la función afectan el crecimiento y desarrollo fetal en múltiples contextos de enfermedades.
Introduction
La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función1. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas de órganos específicos en el feto. En particular, las anomalías en la placenta están relacionadas con cambios en el cerebro, el corazón y el sistema vascular fetales 2,3,4,5.
El transporte de hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas de la placenta al feto juega un papel importante en el desarrollo fetal6. Se ha demostrado que alterar la producción placentaria de moléculas específicas puede alterar el neurodesarrollo. La inflamación materna puede aumentar la producción de serotonina al alterar la expresión génica metabólica del triptófano (TRP) en la placenta, lo que posteriormente crea una acumulación de serotonina en el cerebro fetal7. Otros estudios han encontrado anomalías placentarias junto con defectos cardíacos. Se cree que las anomalías en la placenta contribuyen a los defectos cardíacos congénitos, el defecto congénito más común en los seres humanos8. Un estudio reciente ha identificado varios genes que tienen vías celulares similares tanto en la placenta como en el corazón. Si se interrumpen, estas vías podrían causar defectos en ambos órganos9. Los defectos en la placenta pueden exacerbar los defectos cardíacos congénitos. El papel de la genética placentaria y la función en el desarrollo de sistemas específicos de órganos fetales es un campo de estudio emergente.
Los ratones tienen placentas hemocoriales y otras características de las placentas humanas, lo que los convierte en modelos muy útiles para estudiar enfermedades humanas1. A pesar de la importancia de la placenta, actualmente hay una falta de manipulaciones genéticas in vivo dirigidas. Además, actualmente hay más opciones disponibles para knockouts o knockdowns que manipulaciones de sobreexpresión o ganancia de función en la placenta10. Hay varias líneas transgénicas que expresan Cre para la manipulación placentaria específica, cada una en diferentes linajes de trofoblastos en diferentes puntos de tiempo. Estos incluyen Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER y Gcm1-Cre 11,12,13,14. Si bien estos transgenes Cre son eficientes, es posible que no sean capaces de manipular algunos genes en puntos de tiempo específicos. Otro método comúnmente utilizado para noquear o sobreexpresar la expresión génica placentaria es la inserción de vectores lentivirales en el cultivo de blastocisto, lo que causa una manipulación genética específica del trofoblasto15,16. Esta técnica permite un cambio robusto en la expresión génica placentaria al principio del desarrollo. El uso de la interferencia de ARN in vivo se ha utilizado escasamente en la placenta. La inserción de plásmidos de ARNsh se puede realizar de manera similar a la técnica CRIPSR descrita en este artículo. Esto se ha hecho en E13.5 para disminuir con éxito la expresión de PlGF en la placenta, con impactos en la vasculatura cerebral de la descendencia17.
Además de las técnicas que se utilizan principalmente para knockout o knockdown, la inducción de la sobreexpresión se realiza comúnmente con adenovirus o la inserción de una proteína exógena. Las técnicas utilizadas para la sobreexpresión tienen diferentes tasas de éxito y en su mayoría se han realizado más tarde en la gestación. Para investigar el papel del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en la función placentaria, se realizó una transferencia génica placentaria mediada por adenovirus para inducir la sobreexpresión del gen IGF-1 18,19. Esto se realizó al final de la gestación del ratón en E18.5 mediante inyección placentaria directa. Para proporcionar opciones adicionales y eludir posibles fallos de manipulaciones genéticas placentarias establecidas, como fallos de combinación Cre-Lox, la posible toxicidad de adenovirus y los efectos fuera del objetivo del ARNsh, se puede utilizar la manipulación directa in vivo de CRISPR de la placenta20,21,22. Este modelo fue desarrollado para abordar la falta de modelos de sobreexpresión y para crear un modelo con flexibilidad.
Esta técnica se basa en el trabajo de Lecuyer et al., en el que los plásmidos shRNA y CRISPR fueron dirigidos directamente in vivo a placentas de ratón para alterar la expresión de PlGF 17. Esta técnica se puede utilizar para alterar directamente la expresión génica placentaria mediante la manipulación CRISPR en múltiples puntos de tiempo; para este trabajo, se seleccionó E12.5. La placenta ha madurado en este punto y es lo suficientemente grande como para manipularla, lo que permite la inserción de un plásmido CRISPR específico en E12.5, que puede tener un impacto significativo en el desarrollo fetal desde mediados hasta finales del embarazo23,24. A diferencia de los enfoques transgénicos, pero similares a las inducciones virales o la interferencia de ARN, esta técnica permite la sobreexpresión o el knockout en puntos de tiempo particulares utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, evitando así posibles alteraciones de la placenta o letalidad embrionaria de cambios anteriores. Como solo unas pocas placentas reciben el plásmido experimental o de control dentro de una camada, el enfoque permite dos tipos de controles internos. Estos controles son los inyectados y electroporados con el plásmido de control adecuado y los que no reciben manipulación directa. Esta técnica se optimizó para crear una sobreexpresión del gen IGF-1 en la placenta del ratón a través de un plásmido CRISPR mediador de activación sinérgico (SAM). Se eligió el gen IGF-1, ya que el IGF-1 es una hormona de crecimiento esencial entregada al feto que se produce principalmente en la placenta antes del nacimiento25,26. Esta nueva técnica CRISPR dirigida a la placenta permitirá la manipulación directa para ayudar a definir la conexión entre la función placentaria y el desarrollo fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
La placenta es un regulador primario del crecimiento fetal y, como se señaló anteriormente, los cambios en la expresión o función génica de la placenta pueden afectar significativamente el desarrollo fetal6. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para realizar una manipulación CRISPR in vivo dirigida de la placenta del ratón utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado. Esta técnica permite un rendimiento significativo de embriones viables y sus correspondientes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiamiento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 y NIH T32GM145441. Los autores agradecen a los laboratorios del Dr. Val Sheffield y el Dr. Calvin Carter en la Universidad de Iowa por el uso de su sala de cirugía y equipo, así como al Dr. Eric Van Otterloo, el Dr. Nandakumar Narayanan y el Dr. Matthew Weber por su ayuda con la microscopía. Sara Maurer, Maya Evans y Sreelekha Kundu por su ayuda con las cirugías piloto.
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
