マウス インビボ 胎盤標的CRISPR操作
Summary
ここでは、マウス胎盤の重要な発生経路を in vivoで効果的に操作するための時間特異的な方法について説明します。これは、CRISPRプラスミドを妊娠ダムの胎盤に注入し、エレクトロポレーションすることによって行われます 12.5.
Abstract
胎盤は、 子宮内の哺乳類の発達を調節および維持する重要な器官です。胎盤は、母親と胎児の間の栄養素と老廃物の移動、および成長因子とホルモンの産生と送達に関与しています。マウスの胎盤遺伝子操作は、胎盤の出生前発達における特定の役割を理解するために重要です。胎盤特異的Cre発現トランスジェニックマウスは様々な有効性を有し、胎盤遺伝子操作のための他の方法は有用な代替手段となり得る。本論文では、CRISPR遺伝子操作を用いて胎盤遺伝子発現を直接変化させる技術について述べ、標的遺伝子の発現を改変することができる。比較的高度な外科的アプローチを使用して、妊娠中のダムは胚の12.5日目(E12.5)に開腹術を受け、CRISPRプラスミドはガラスマイクロピペットによって個々の胎盤に送達されます。プラスミドは、各注入後直ちにエレクトロポレーションされます。ダムの回復後、胎盤と胚は後の時点で評価されるまで発生を続けることができます。この技術を使用した後の胎盤および子孫の評価は、発生における時間特異的胎盤機能の役割を決定することができる。このタイプの操作により、胎盤の遺伝学と機能が複数の疾患の状況における胎児の成長と発達にどのように影響するかをよりよく理解することができます。
Introduction
胎盤は胎児の発育に関与する必須の器官です。胎盤の主な役割は、必須の要素を提供し、胎児との間の栄養素と老廃物の移動を調節することです。哺乳類の胎盤は、胎児と母体の界面を構成する胎児組織と母体組織の両方で構成されているため、母親と胎児の両方の遺伝学が機能に影響を与えます1。胎盤の遺伝的異常または機能障害は、胎児の発育を劇的に変化させる可能性があります。以前の研究では、胎盤の遺伝学と発達が胎児の特定の臓器系の発達の変化に関連していることが示されています。特に、胎盤の異常は、胎児の脳、心臓、血管系の変化と関連しています2,3,4,5。
胎盤から胎児へのホルモン、成長因子、およびその他の分子の輸送は、胎児の発育に大きな役割を果たします6。特定の分子の胎盤産生を変化させると、神経発達が変化する可能性があることが示されています。母親の炎症は、胎盤におけるトリプトファン(TRP)代謝遺伝子発現を変化させることによってセロトニンの産生を増加させることができ、その後、胎児の脳にセロトニンの蓄積を作り出す7。他の研究では、心臓の欠陥と一緒に胎盤の異常が見つかりました。胎盤の異常は、ヒトで最も一般的な先天性欠損症である先天性心疾患の一因となると考えられています8。最近の研究では、胎盤と心臓の両方で同様の細胞経路を持ついくつかの遺伝子が特定されました。破壊された場合、これらの経路は両方の臓器に欠陥を引き起こす可能性があります9。胎盤の欠陥は先天性心疾患を悪化させる可能性があります。胎盤遺伝学と特定の胎児臓器系の発達における機能の役割は、新たな研究分野です。
マウスは、血球胎盤などヒト胎盤の特徴を有しており、ヒトの疾患を研究するための非常に有用なモデルとなっています1。胎盤の重要性にもかかわらず、現在、標的を絞ったin vivo遺伝子操作が不足しています。さらに、現在、ノックアウトまたはノックダウンには、胎盤10の過剰発現または機能獲得操作よりも多くの選択肢があります。胎盤特異的操作のためのいくつかのトランスジェニックCre発現系統があり、それぞれが異なる時点で異なる栄養膜系統にあります。これらには、Cyp19-Cre、Ada/Tpbpa-Cre、PDGFRα-CreER、およびGcm1-Cre11,12,13,14が含まれる。これらのCre導入遺伝子は効率的ですが、特定の時点で一部の遺伝子を操作することができない場合があります。胎盤遺伝子発現をノックアウトまたは過剰発現させるために一般的に使用される別の方法は、レンチウイルスベクターを胚盤胞培養物に挿入することであり、これは絨毛膜特異的な遺伝子操作を引き起こす15,16。この技術は、発生の初期における胎盤遺伝子発現の堅牢な変化を可能にする。生体内でのRNA干渉の使用は、胎盤ではまばらに利用されています。shRNAプラスミドの挿入は、本論文に記載のCRIPSR法と同様に行うことができる。これはE13.5で行われ、胎盤でのPlGF発現を正常に減少させ、子孫の脳血管系に影響を与えました17。
主にノックアウトまたはノックダウンに使用される技術に加えて、過剰発現の誘導は、一般的にアデノウイルスまたは外因性タンパク質の挿入によって行われる。過剰発現に使用される技術は、成功率にばらつきがあり、主に妊娠後期に実施されています。胎盤機能におけるインスリン様成長因子1(IGF-1)の役割を調べるために、IGF-1遺伝子の過剰発現を誘導するために、アデノウイルス媒介胎盤遺伝子導入が行われた18,19。これは、E18.5のマウス妊娠後期に直接胎盤注射を介して実施されました。追加の選択肢を提供し、Cre−Lox併用の失敗、アデノウイルスの毒性の可能性、およびshRNAのオフターゲット効果などの確立された胎盤遺伝子操作の起こり得る失敗を回避するために、胎盤のin vivo直接CRISPR操作を使用することができる20、21、22。このモデルは、過剰発現モデルの欠如に対処し、柔軟性のあるモデルを作成するために開発されました。
この技術はLecuyerらの研究に基づいており、shRNAおよびCRISPRプラスミドをin vivoでマウス胎盤に直接標的化してPlGF発現を変化させました17。この手法は、複数の時点でCRISPR操作を使用して胎盤遺伝子発現を直接変更するために使用できます。この作業では、E12.5が選択されました。胎盤はこの時点で成熟しており、操作するのに十分な大きさであり、E12.5に特定のCRISPRプラスミドを挿入することができ、妊娠中期から後期の胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります23,24。トランスジェニックアプローチとは異なり、ウイルス誘導やRNA干渉に似ていますが、この技術は、比較的高度な外科的アプローチを使用して特定の時点で過剰発現またはノックアウトを可能にするため、以前の変化による胎盤形成障害または胚致死の可能性を回避します。同腹仔内で実験プラスミドまたは対照プラスミドを受け取る胎盤はごくわずかであるため、このアプローチでは2種類の内部コントロールが可能になります。これらのコントロールは、適切なコントロールプラスミドを注入およびエレクトロポレーションしたものであり、直接操作を受けないものである。この技術は、相乗的活性化メディエーター(SAM)CRISPRプラスミドを介してマウス胎盤にIGF-1遺伝子の過剰発現を作り出すように最適化されました。IGF-1は胎児に送達される必須の成長ホルモンであり、主に出生前に胎盤で産生されるため、IGF-1遺伝子が選択されました25,26。この新しい胎盤を標的としたCRISPR技術により、胎盤機能と胎児の発育との関係を定義するのに役立つ直接操作が可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
胎盤は胎児の成長の主要な調節因子であり、前述のように、胎盤の遺伝子発現または機能の変化は胎児の発育に大きな影響を与える可能性があります6。ここで概説したプロトコルは、比較的高度な外科的アプローチを使用して、マウス胎盤の標的in vivo CRISPR操作を実行するために使用できます。この技術により、生存可能な胚とそれに対応する胎盤のかなりの収量が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、R01 MH122435、NIH T32GM008629、およびNIH T32GM145441の資金源を認めている。著者らは、アイオワ大学のヴァル・シェフィールド博士とカルビン・カーター博士の研究室が手術室と機器を使用してくれたこと、そして顕微鏡検査の支援をしてくれたエリック・ヴァン・オッタールー博士、ナンダクマール・ナラヤナン博士、マシュー・ウェーバー博士に感謝の意を表した。著者はまた、パイロット手術を支援してくれたサラ・マウラー博士、マヤ・エバンス博士、スリーレカ・クンドゥ博士にも感謝しています。
Materials
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD – Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 – 44 – 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂ |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24×60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD – Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
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