Methoden zur Untersuchung des Beitrags der Gebärmutter zur Schwangerschaftsbegründung in einem ovariektomierten Mausmodell
Summary
Die Etablierung einer Schwangerschaft ist ein dynamischer Prozess, bei dem es zu komplexen Wechselwirkungen zwischen Embryo und Gebärmutter kommt. Der genaue Beitrag der mütterlichen Gebärmutterumgebung zu diesen Prozessen ist nach wie vor ein aktives Forschungsgebiet. Hier werden detaillierte Protokolle zur Verfügung gestellt, die bei der Entwicklung von In-vivo-Tiermodellen helfen, um diese Forschungsfragen zu beantworten.
Abstract
Damit eine Schwangerschaft festgestellt werden kann, muss eine lebensfähige Blastozyste erfolgreich mit einer empfänglichen Gebärmutterschleimhaut (Endometrium) interagieren, um die Einnistung und Plazentabildung zu erleichtern und eine weitere Schwangerschaft zu ermöglichen. Die Einschränkungen des Schwangerschaftserfolgs durch embryonale Defekte sind bekannt und wurden in den letzten Jahrzehnten mit dem Aufkommen der In-vitro-Fertilisation (IVF) und der assistierten Reproduktionstechnologien weitgehend überwunden. Bisher hat das Feld jedoch noch nicht die Einschränkungen überwunden, die durch ein unzureichend empfängliches Endometrium verursacht werden, was zu stagnierenden IVF-Erfolgsraten führt. Die Funktionen der Eierstöcke und des Endometriums sind eng miteinander verflochten, da die vom Eierstock produzierten Hormone für den Menstruationszyklus der Gebärmutterschleimhaut verantwortlich sind. Daher kann es bei der Verwendung von Nagetiermodellen für die Schwangerschaft schwierig sein, festzustellen, ob ein beobachtetes Ergebnis auf ein Defizit der Eierstöcke oder der Gebärmutter zurückzuführen ist. Um dies zu überwinden, wurde ein ovariektomiertes Mausmodell mit Embryotransfer oder künstlicher Dezidualisierung entwickelt, um die Untersuchung der uterinspezifischen Beiträge zur Schwangerschaft zu ermöglichen. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Durchführung einer Ovariektomie und bietet Einblicke in verschiedene Techniken zur Zufuhr exogener Hormone zur Unterstützung einer erfolgreichen künstlichen Dezidualisierung oder Schwangerschaft nach dem Embryotransfer von gesunden Spendern. Zu diesen Techniken gehören subkutane Injektionen, langsam freisetzende Pellets und osmotische Minipumpen. Die wichtigsten Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden werden diskutiert, so dass die Forschenden das beste Studiendesign für ihre spezifische Forschungsfrage auswählen können.
Introduction
Mit dem zunehmenden Einsatz von assistierten Reproduktionstechnologien in den letzten Jahrzehnten wurden viele Hindernisse für die Empfängnis überwunden, so dass viele Paare trotz Fruchtbarkeitsproblemen eine Familie gründen konnten1. Eizell- oder Spermiendefizite können oft durch In-vitro-Fertilisation oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion umgangen werden. Probleme im Zusammenhang mit der Gebärmutter und der Empfänglichkeit des Endometriums bleiben jedoch eine schwer fassbare “Black Box” des Fortpflanzungspotenzials2.
Eine Schwangerschaft ist dann gegeben, wenn ein hochwertiger Embryo erfolgreich mit einem empfänglichen Endometrium (Gebärmutterschleimhaut) interagiert. Die Chancen auf eine erfolgreiche Schwangerschaft in einem bestimmten Menstruationszyklus sind mit etwa 30 % gering3,4. Von denen, die erfolgreich sind, kommen nur 50%-60% über die 20. Schwangerschaftswoche hinaus, wobei das Implantationsversagen für 75% der Schwangerschaften verantwortlich ist, die nicht die 20. Schwangerschaftswoche erreichen3. Trotz dieser Zahlen, die bis in die späten 1990er Jahre zurückreichen, hat das Feld noch nicht die Einschränkungen überwunden, die durch ein unzureichend empfängliches Endometrium verursacht werden. Dies hat in den letzten Jahren zu stagnierenden – und manchmal rückläufigen – IVF-Erfolgsraten geführt 5,6.
Frauen mit unerklärlicher Unfruchtbarkeit haben oft ein verschobenes Fenster der Empfänglichkeit oder sind aus unbekannten Gründen nicht in der Lage, Empfänglichkeit zu erreichen. Kürzlich wurde das Endometrium-Rezeptivitäts-Array entwickelt, das die Expression von Hunderten von Genen bewertet, um den Zeitpunkt des Embryotransfers auf das Empfänglichkeitsfenster eines Individuums zuzuschneiden 7,8,9. Allerdings fehlt es noch an Verständnis für die Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen, die sich nach Abschluss des Implantationsprozesses manifestieren.
Das weibliche Fortpflanzungssystem ist hochdynamisch und steht unter strenger hormoneller Kontrolle. Die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) steuert die Freisetzung des luteinisierenden Hormons und des follikelstimulierenden Hormons, die Aspekte des Eierstockzyklus regulieren, einschließlich der Follikelreifung und der Östrogen- und Progesteronaktivität. Der Menstruationszyklus der Gebärmutter wiederum wird durch Östrogene und Progesteron reguliert10,11. Daher wird die Untersuchung der biologischen Mechanismen der Gebärmutter durch den Einfluss der Eierstöcke erschwert. Wenn man beispielsweise untersucht, wie sich Krebstherapien auf die Gebärmutter auswirken können, kann es schwierig sein zu unterscheiden, ob ein beobachteter Uterusphänotyp (wie Fehlgeburten oder Menstruationsazyklizität) das Ergebnis einer direkten Schädigung der Gebärmutter oder einer Folgewirkung einer Schädigung der Eierstöcke ist.
Um die Fruchtbarkeit umfassend zu verstehen, müssen die Beiträge der Gebärmutter zur Schwangerschaft charakterisiert werden. Wichtig ist, dass dieses Verständnis über die Gebärmutterfunktion unter ovarieller Kontrolle hinausgeht. Dies kann nicht am Menschen untersucht werden; Daher werden häufig Tiermodelle verwendet. Daher wird die Ovariektomie (OVX) häufig verwendet, um Forschern die Möglichkeit zu geben, den Brunstzyklus von Nagetieren (analog zum Menstruationszyklus) durch exogene Zufuhr von Hormonen zu regulieren. Darüber hinaus ermöglicht OVX die Untersuchung von Uterusreaktionen unabhängig vom Einfluss der Eierstöcke12. Wenn jedoch nach OVX nicht sofort Hormone zugeführt werden, kommt es zu einem Phänotyp in den Wechseljahren, der von den Forschern sorgfältig berücksichtigt werden muss.
OVX wird häufig in den Nagetiermodellen 13,14,15,16,17 verwendet und ist nach angemessenem Training relativ einfach durchzuführen. Die Methoden variieren je nachdem, ob nur der Eierstock oder der Eierstock und der Eileiter entfernt werden, sowie je nach Alter des Tieres (erwachsene, zyklische Tiere haben größere Eierstöcke mit einem sichtbaren Gelbkörper auf ihrer Oberfläche, was bedeutet, dass ihre Eierstöcke leichter sichtbar sind). In ähnlicher Weise gibt es viele Methoden der Hormonergänzung, darunter subkutane Injektionen14, langsam freisetzende Pellets15, osmotische Minipumpen18 und Eierstocktransplantationen.
In diesem Artikel finden Sie detaillierte Anweisungen zur Durchführung einer Ovariektomie und zur Vorbereitung von drei Arten von Hormonergänzungen, darunter subkutane Injektionen, Pellets mit langsamer Freisetzung und osmotische Minipumpen. Es werden zwei detaillierte Protokolle für experimentelle Endpunkte bereitgestellt, die von OVX profitieren, gefolgt von einer exogenen Hormonsupplementierung (Embryotransfer und künstliche Dezidualisierung). Dieser Artikel erörtert die Stärken und Schwächen der einzelnen Ansätze mit dem Ziel, Forscher bei der Durchführung von Studien zur Isolierung der Auswirkungen auf die Gebärmutter zu unterstützen, insbesondere in den Forschungsbereichen Schwangerschaft und Fruchtbarkeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung von OVX und zur Bereitstellung exogener Hormone für Studien, die sich auf das Verständnis der Beiträge der Gebärmutter zu Schwangerschaft und Fruchtbarkeit konzentrieren. Es werden zwei detaillierte Protokolle zu zwei experimentellen Anwendungen dieser Methoden zur Verfügung gestellt, einschließlich der Durchführung des Embryotransfers und der künstlichen Induktion der Dezidualisierung.
Während die Durchfüh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der operativen Infrastruktur der Regierung des Bundesstaates Victoria und den National Health and Medical Research Council (NHMRC) der australischen Regierung IRIRIS ermöglicht. Diese Arbeit wurde von der Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) unterstützt, um Zugang zur Monash Reproductive Services Platform zu erhalten. A.L.W. wird durch die DECRA-Förderung DE21010037 des Australian Research Council (ARC) unterstützt. J.N.H. und L.R.A. werden durch ein Stipendium des Australian Government Research Training Program unterstützt. L.R.A. wird durch ein Monash Graduate Excellence Stipendium unterstützt. K.J.H. wird durch ein ARC Future Fellowship FT190100265 unterstützt.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
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