Metodi per studiare i contributi uterini all'instaurazione della gravidanza in un modello murino ovariectomizzato
Summary
L’instaurazione della gravidanza è un processo dinamico che coinvolge l’embrione complesso e la diafonia uterina. I contributi precisi dell’ambiente uterino materno a questi processi rimangono un’area attiva di indagine. Qui, vengono forniti protocolli dettagliati per aiutare a progettare modelli animali in vivo per affrontare queste domande di ricerca.
Abstract
Affinché la gravidanza sia stabilita, una blastocisti vitale deve interagire con successo con un rivestimento uterino ricettivo (endometrio) per facilitare l’impianto e la formazione della placenta e consentire la gravidanza in corso. I limiti al successo della gravidanza causati da difetti embrionali sono ben noti e sono stati ampiamente superati negli ultimi decenni con l’aumento della fecondazione in vitro (IVF) e delle tecnologie di riproduzione assistita. Finora, tuttavia, il campo non ha superato i limiti causati da un endometrio inadeguatamente ricettivo, con conseguente stagnazione dei tassi di successo della fecondazione in vitro. Le funzioni ovariche ed endometriali sono strettamente intrecciate, poiché gli ormoni prodotti dall’ovaio sono responsabili della ciclicità mestruale dell’endometrio. Pertanto, quando si utilizzano modelli di roditori di gravidanza, può essere difficile accertare se un risultato osservato è dovuto a un deficit ovarico o uterino. Per ovviare a questo, è stato sviluppato un modello murino ovariectomizzato con trasferimento embrionale o decidualizzazione artificiale per consentire lo studio dei contributi specifici dell’utero alla gravidanza. Questo articolo fornirà istruzioni su come eseguire l’ovariectomia e offrirà approfondimenti su varie tecniche per la fornitura di ormoni esogeni per supportare la decidualizzazione artificiale di successo o la gravidanza dopo il trasferimento di embrioni da donatori sani. Queste tecniche includono iniezione sottocutanea, pellet a lento rilascio e mini pompe osmotiche. Saranno discussi i principali vantaggi e svantaggi di ciascun metodo, consentendo ai ricercatori di scegliere il miglior disegno di studio per la loro specifica domanda di ricerca.
Introduction
Con il crescente uso delle tecnologie di riproduzione assistita negli ultimi decenni, molte barriere al concepimento sono state superate, consentendo a molte coppie di creare una famiglia nonostante i problemi di fertilità1. I deficit di ovociti o spermatozoi possono spesso essere bypassati utilizzando la fecondazione in vitro o l’iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi; Tuttavia, le questioni relative all’utero e alla ricettività endometriale rimangono una sfuggente “scatola nera” del potenziale riproduttivo2.
La gravidanza è stabilita quando un embrione di alta qualità interagisce con successo con un endometrio ricettivo (rivestimento uterino). Le probabilità di successo di una gravidanza in un dato ciclo mestruale sono basse, intorno al 30%3,4. Di quelle che hanno successo, solo il 50% -60% avanza oltre le 20 settimane di gestazione, con il fallimento dell’impianto responsabile del 75% delle gravidanze che non raggiungono le 20 settimane3. Nonostante queste cifre risalgano alla fine del 1990, il campo deve ancora superare i limiti causati da un endometrio inadeguatamente ricettivo. Ciò ha comportato tassi di successo della fecondazione in vitro stagnanti – e talvolta in calo – negli ultimi anni 5,6.
Le donne con infertilità inspiegabile hanno spesso una finestra spostata di ricettività o non sono in grado di raggiungere la ricettività per ragioni sconosciute. Recentemente è stato sviluppato l’array di ricettività endometriale, che valuta l’espressione di centinaia di geni con lo scopo di adattare i tempi del trasferimento embrionale alla finestra di ricettività di un individuo 7,8,9. Tuttavia, il campo manca ancora di una comprensione della patogenesi delle complicanze della gravidanza che si manifestano dopo che il processo di impianto è completo.
Il sistema riproduttivo femminile è altamente dinamico e sotto stretto controllo ormonale. L’asse ipotalamo-ipofisi-gonadia (HPG) controlla il rilascio dell’ormone luteinizzante e dell’ormone follicolo-stimolante, che regolano aspetti del ciclo ovarico, tra cui la maturazione del follicolo e l’attività degli estrogeni e del progesterone. A sua volta, il ciclo mestruale uterino è regolato da estrogeni e progesterone10,11. Pertanto, lo studio dei meccanismi biologici uterini è complicato dall’influenza ovarica. Ad esempio, quando si studia come le terapie antitumorali possono avere un impatto sull’utero, può essere difficile distinguere se qualsiasi fenotipo uterino osservato (come la perdita di gravidanza o l’aciclicità mestruale) è il risultato di un insulto diretto all’utero o di un effetto consequenziale da danni alle ovaie.
Per comprendere in modo completo la fertilità, i contributi uterini alla gravidanza devono essere caratterizzati. È importante sottolineare che questa comprensione deve estendersi oltre la funzione uterina sotto controllo ovarico. Questo non può essere studiato negli esseri umani; Pertanto, vengono spesso impiegati modelli animali. Come tale, l’ovariectomia (OVX) è comunemente usata per consentire ai ricercatori di regolare i cicli estrali dei roditori (analoghi al ciclo mestruale) fornendo ormoni esogeni. Inoltre, OVX consente di studiare le risposte uterine indipendentemente dall’influenza ovarica12. Tuttavia, se gli ormoni non vengono immediatamente forniti dopo l’OVX, si verificherà un fenotipo della menopausa, che deve essere attentamente considerato dai ricercatori.
OVX è frequentemente utilizzato nei modelli di roditori 13,14,15,16,17 ed è relativamente facile da eseguire dopo un adeguato allenamento. I metodi variano a seconda che l’ovaio da solo o l’ovaio e l’ovidotto vengano rimossi, nonché a seconda dell’età dell’animale (gli animali adulti in bicicletta hanno ovaie più grandi con un corpo luteo visibile sulla loro superficie, il che significa che le loro ovaie sono più facili da visualizzare). Allo stesso modo, esistono molti metodi di integrazione ormonale, tra cui iniezioni sottocutanee14, pellet a lento rilascio 15, mini pompe osmotiche18 e innesto ovarico.
In questo articolo, vengono fornite istruzioni dettagliate su come eseguire l’ovariectomia e preparare tre tipi di integrazione ormonale, tra cui iniezioni sottocutanee, pellet a lento rilascio e mini pompe osmotiche. Vengono forniti due protocolli dettagliati per endpoint sperimentali che beneficiano di OVX seguiti da supplementazione ormonale esogena (trasferimento embrionale e decidualizzazione artificiale). Questo articolo discute i punti di forza e di debolezza di ciascun approccio con l’obiettivo di guidare i ricercatori su come eseguire studi per isolare gli impatti sull’utero, in particolare nei campi di ricerca sulla gravidanza e sulla fertilità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate su come eseguire OVX e fornire ormoni esogeni per studi incentrati sulla comprensione dei contributi uterini alla gravidanza e alla fertilità. Vengono forniti due protocolli dettagliati su due applicazioni sperimentali di questi metodi, tra cui l’esecuzione del trasferimento di embrioni e l’induzione della decidualizzazione artificialmente.
Mentre l’esecuzione di OVX può essere inizialmente impegnativa – specialmente per i ricercatori nuovi ai …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile grazie al Victorian State Government Operational Infrastructure Support e all’Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Questo lavoro è stato supportato dalla Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) per accedere alla Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. è supportato dal finanziamento DECRA DE21010037 dell’Australian Research Council (ARC). J.N.H. e L.R.A. sono supportati da una borsa di studio del programma di formazione per la ricerca del governo australiano. L.R.A. è supportato da una borsa di studio Monash Graduate Excellence. K.J.H. è supportato da una ARC Future Fellowship FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
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