Методы изучения вклада матки в установление беременности на овариэктомированной мышиной модели
Summary
Установление беременности – это динамический процесс, включающий сложные перекрестные помехи эмбриона и матки. Точный вклад материнской маточной среды в эти процессы остается активной областью исследований. Здесь представлены подробные протоколы, помогающие в разработке моделей животных in vivo для решения этих исследовательских вопросов.
Abstract
Чтобы беременность была установлена, жизнеспособная бластоциста должна успешно взаимодействовать с рецептивной слизистой оболочкой матки (эндометрием), чтобы облегчить имплантацию и формирование плаценты и обеспечить продолжение беременности. Ограничения на успешность беременности, вызванные эмбриональными дефектами, хорошо известны и были в значительной степени преодолены в последние десятилетия с появлением экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и вспомогательных репродуктивных технологий. Однако до сих пор эта область не преодолела ограничения, вызванные недостаточно рецептивным эндометрием, что приводит к стагнации показателей успешности ЭКО. Функции яичников и эндометрия тесно переплетены, так как гормоны, вырабатываемые яичником, отвечают за менструальную цикличность эндометрия. Таким образом, при использовании моделей беременности на грызунах может быть трудно определить, связан ли наблюдаемый результат с дефицитом яичников или матки. Чтобы преодолеть это, была разработана овариэктомия мышиной модели с переносом эмбрионов или искусственной децидуализацией, чтобы можно было изучить специфический для матки вклад в беременность. В этой статье будут представлены инструкции о том, как выполнить овариэктомию, и предложены различные методы поставки экзогенных гормонов для поддержки успешной искусственной децидуализации или беременности после переноса эмбрионов от здоровых доноров. Эти методы включают подкожные инъекции, гранулы с медленным высвобождением и осмотические мини-насосы. Будут обсуждаться основные преимущества и недостатки каждого метода, что позволит исследователям выбрать наилучший дизайн исследования для своего конкретного исследовательского вопроса.
Introduction
С ростом использования вспомогательных репродуктивных технологий в последние десятилетия многие барьеры на пути к зачатию были преодолены, что позволило многим парам создавать семьи, несмотря на проблемы с фертильностью1. Дефицит ооцитов или сперматозоидов часто можно обойти с помощью экстракорпорального оплодотворения или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида; Однако проблемы, связанные с маткой и восприимчивостью эндометрия, остаются неуловимым «черным ящиком» репродуктивного потенциала2.
Беременность устанавливается, когда качественный эмбрион успешно взаимодействует с рецептивным эндометрием (слизистой оболочкой матки). Шансы на успешную беременность в любом менструальном цикле невелики и составляют около 30%3,4. Из тех, которые успешны, только 50-60% продвигаются после 20 недель беременности, при этом неудача имплантации является причиной 75% беременностей, которые не достигают 20 недель3. Несмотря на то, что эти цифры относятся к концу 1990-х годов, этой области еще предстоит преодолеть ограничения, вызванные недостаточно рецептивным эндометрием. Это привело к стагнации, а иногда и к снижению показателей успешности ЭКО в последние годы 5,6.
Женщины с необъяснимым бесплодием часто имеют смещенное окно восприимчивости или не могут достичь восприимчивости по неизвестным причинам. Недавно был разработан массив рецептивности эндометрия, который оценивает экспрессию сотен генов с целью адаптации времени переноса эмбрионов к окну восприимчивости человека 7,8,9. Тем не менее, в этой области до сих пор отсутствует понимание патогенеза осложнений беременности, которые проявляются после завершения процесса имплантации.
Женская репродуктивная система очень динамична и находится под жестким гормональным контролем. Гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось (HPG) контролирует высвобождение лютеинизирующего гормона и фолликулостимулирующего гормона, которые регулируют аспекты овариального цикла, включая созревание фолликулов и активность эстрогена и прогестерона. В свою очередь, менструальный цикл матки регулируется эстрогенами и прогестероном10,11. Таким образом, изучение биологических механизмов матки осложняется влиянием яичников. Например, при изучении того, как терапия рака может повлиять на матку, может быть трудно различить, является ли какой-либо наблюдаемый фенотип матки (например, потеря беременности или менструальная ацикличность) результатом прямого оскорбления матки или косвенного эффекта от повреждения яичников.
Чтобы всесторонне понять фертильность, необходимо охарактеризовать вклад матки в беременность. Важно отметить, что это понимание должно выходить за рамки функции матки под контролем яичников. Это не может быть изучено на людях; Поэтому часто используются модели животных. Таким образом, овариэктомия (OVX) обычно используется для того, чтобы позволить исследователям регулировать эстральные циклы грызунов (аналогично менструальному циклу) путем экзогенного снабжения гормонами. Кроме того, OVX позволяет изучать реакцию матки независимо от влияния яичников12. Однако, если гормоны не будут немедленно доставлены после OVX, возникнет фенотип менопаузы, который должен быть тщательно рассмотрен исследователями.
OVX часто используется в моделях грызунов 13,14,15,16,17 и относительно легко выполняется после адекватного обучения. Методы варьируются в зависимости от того, удаляется ли только яичник или яичник и яйцевод, а также в зависимости от возраста животного (взрослые животные имеют более крупные яичники с видимым желтым телом на поверхности, что означает, что их яичники легче визуализировать). Точно так же существует множество методов гормональных добавок, включая подкожные инъекции14, гранулы с медленным высвобождением 15, осмотической мини-помпы18 и пересадку яичников.
В этой статье приведены подробные инструкции о том, как выполнять овариэктомию и готовить три типа гормональных добавок, включая подкожные инъекции, гранулы с медленным высвобождением и осмотические мини-помпы. Два подробных протокола предоставляются для экспериментальных конечных точек, которые выигрывают от OVX с последующим добавлением экзогенных гормонов (перенос эмбрионов и искусственная децидуализация). В этой статье обсуждаются сильные и слабые стороны каждого подхода с целью руководства исследователями относительно того, как проводить исследования, чтобы изолировать воздействие на матку, особенно в областях исследований беременности и фертильности.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлены пошаговые инструкции о том, как выполнять OVX и предоставлять экзогенные гормоны для исследований, направленных на понимание вклада матки в беременность и фертильность. Представлены два подробных протокола по двум экспериментальным применениям этих методов,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стала возможной благодаря поддержке оперативной инфраструктуры правительства штата Виктория и Национальному совету по здравоохранению и медицинским исследованиям правительства Австралии (NHMRC) IRIISS. Эта работа была поддержана грантом на доступ к платформе медицины, сестринского дела и медицинских наук Университета Монаша для A.L.W. (Winship-PAG18-0343) для доступа к платформе репродуктивных услуг Монаша. A.L.W. поддерживается финансированием DECRA DE21010037 от Австралийского исследовательского совета (ARC). J.N.H. и L.R.A. поддерживаются стипендией Австралийской правительственной программы обучения исследованиям. L.R.A. поддерживается стипендией Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. поддерживается стипендией ARC Future Fellowship FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
