Graviditetsetablering er en dynamisk prosess som involverer kompleks embryo- og livmorkrysstale. De nøyaktige bidragene fra mors livmormiljø til disse prosessene forblir et aktivt undersøkelsesområde. Her er detaljerte protokoller gitt for å hjelpe til med å designe in vivo dyremodeller for å løse disse forskningsspørsmålene.
For graviditet som skal etableres, må en levedyktig blastocyst vellykket samhandle med en mottakelig livmorforing (endometrium) for å lette implantasjon og morkakedannelse og muliggjøre pågående graviditet. Begrensningene til graviditetssuksess forårsaket av embryonale defekter er velkjente og har i stor grad blitt overvunnet de siste tiårene med økningen av in vitro fertilisering (IVF) og assistert reproduktiv teknologi. Foreløpig har feltet imidlertid ikke overvunnet begrensningene forårsaket av et utilstrekkelig mottakelig endometrium, noe som resulterer i stagnerende IVF-suksessrater. Ovarie- og endometriefunksjoner er tett sammenflettet, da hormoner produsert av eggstokken er ansvarlige for endometriums menstruasjonssyklisitet. Som sådan, når du bruker gnagermodeller av graviditet, kan det være vanskelig å fastslå om et observert resultat skyldes et eggstokk- eller livmorunderskudd. For å overvinne dette ble en ovariektomisert musemodell utviklet med embryooverføring eller kunstig decidualisering for å tillate studier av livmorspesifikke bidrag til graviditet. Denne artikkelen vil gi instruksjoner om hvordan du utfører ovariektomi og gi innsikt i ulike teknikker for å levere eksogene hormoner for å støtte vellykket kunstig decidualization eller graviditet etter embryooverføring fra friske givere. Disse teknikkene inkluderer subkutan injeksjon, pellets med langsom frigjøring og osmotiske minipumper. De viktigste fordelene og ulempene ved hver metode vil bli diskutert, slik at forskere kan velge det beste studiedesignet for deres spesifikke forskningsspørsmål.
Med den økende bruken av assistert befruktning de siste tiårene, har mange barrierer for unnfangelse blitt overvunnet, slik at mange par kan starte familier til tross for fruktbarhetsproblemer1. Oocytt- eller sædunderskudd kan ofte omgås ved bruk av in vitro fertilisering eller intracytoplasmatisk spermieinjeksjon; Imidlertid forblir problemer knyttet til livmor og endometriell mottakelighet en unnvikende “svart boks” av reproduktivt potensial2.
Graviditet er etablert når et embryo av høy kvalitet vellykket interagerer med et mottakelig endometrium (livmorforing). Sjansene for vellykket graviditet i en gitt menstruasjonssyklus er lave, på rundt 30%3,4. Av de som lykkes, går bare 50% -60% forbi 20 ukers svangerskap, med implantasjonssvikt som ansvarlig for 75% av graviditetene som ikke når 20 uker3. Til tross for disse tallene som dateres tilbake til slutten av 1990-tallet, er feltet ennå ikke overvunnet begrensningene forårsaket av et utilstrekkelig mottakelig endometrium. Dette har resultert i stagnerende – og noen ganger fallende – IVF suksessrater de siste årene 5,6.
Kvinner med uforklarlig infertilitet har ofte et forskjøvet mottakevindu eller er ikke i stand til å oppnå mottakelighet av ukjente årsaker. Nylig ble endometriell reseptivitetsmatrise utviklet, som vurderer uttrykket av hundrevis av gener med det formål å skreddersy tidspunktet for embryooverføring til individets mottakelighetsvindu 7,8,9. Imidlertid mangler feltet fortsatt en forståelse av patogenesen av graviditetskomplikasjoner som manifesterer seg etter at implantasjonsprosessen er fullført.
Det kvinnelige reproduktive systemet er svært dynamisk og under stram hormonell kontroll. Den hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) aksen styrer frigivelsen av luteiniserende hormon og follikkelstimulerende hormon, som regulerer aspekter av eggstokksyklusen, inkludert follikelmodning og østrogen og progesteronaktivitet. I sin tur reguleres livmorens menstruasjonssyklus av østrogener og progesteron10,11. Dermed er studier av livmorbiologiske mekanismer komplisert av ovariepåvirkning. For eksempel, når man studerer hvordan kreftbehandlinger kan påvirke livmoren, kan det være vanskelig å skille om noen livmorfenotype observert (som graviditetstap eller menstruasjonssyklisitet) er et resultat av en direkte fornærmelse mot livmoren eller en følgevirkning fra skade på eggstokkene.
For å forstå fruktbarheten grundig, må livmorbidragene til graviditet karakteriseres. Det er viktig at denne forståelsen må strekke seg utover livmorfunksjonen under ovariekontroll. Dette kan ikke studeres hos mennesker; Derfor brukes ofte dyremodeller. Som sådan brukes ovariektomi (OVX) ofte til å gjøre det mulig for forskere å regulere gnagerbrunstsykluser (analogt med menstruasjonssyklusen) ved å levere hormoner eksogent. I tillegg tillater OVX livmorresponser å bli studert uavhengig av ovariepåvirkning12. Men hvis hormoner ikke umiddelbart tilføres etter OVX, vil en overgangsfenotype slutte, som må vurderes nøye av forskerne.
OVX brukes ofte i gnagermodeller 13,14,15,16,17 og er relativt enkel å utføre etter tilstrekkelig trening. Metodene varierer avhengig av om eggstokken alene eller eggstokken og ovidukten fjernes, samt avhengig av dyrets alder (voksne sykkeldyr har større eggstokker med et synlig corpus luteum på overflaten, noe som betyr at eggstokkene er lettere å visualisere). På samme måte finnes mange metoder for hormontilskudd, inkludert subkutane injeksjoner14, pellets med langsom frigjøring 15, osmotiske minipumper18 og eggstokktransplantasjon.
I denne artikkelen er det gitt detaljerte instruksjoner om hvordan du utfører ovariektomi og forbereder tre typer hormontilskudd, inkludert subkutane injeksjoner, pellets med langsom frigjøring og osmotiske minipumper. To detaljerte protokoller er gitt for eksperimentelle endepunkter som drar nytte av OVX etterfulgt av eksogent hormontilskudd (embryooverføring og kunstig decidualisering). Denne artikkelen diskuterer styrker og svakheter ved hver tilnærming med mål om å veilede forskere om hvordan man utfører studier for å isolere virkningene på livmoren, spesielt i forskningsfeltene graviditet og fruktbarhet.
Denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner om hvordan du utfører OVX og gir eksogene hormoner for studier som fokuserer på å forstå livmorens bidrag til graviditet og fruktbarhet. To detaljerte protokoller er gitt på to eksperimentelle anvendelser av disse metodene, inkludert å utføre embryooverføring og indusere decidualization kunstig.
Selv om det kan være utfordrende å utføre OVX i utgangspunktet – spesielt for forskere som er nye til gnagermodeller – er det en relativt enkel p…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom Victorian State Government Operational Infrastructure Support og Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dette arbeidet ble støttet av Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant til A.L.W. (Winship-PAG18-0343) for å få tilgang til Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. støttes av DECRA finansiering DE21010037 fra Australian Research Council (ARC). JNH og LRA støttes av et australsk regjerings forskningsopplæringsprogramstipend. LRA støttes av et Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. støttes av et ARC Future Fellowship FT190100265.
ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
Estradiol | Sigma | E8875 | |
Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
Sesame oil | Sigma | S3547 | |
Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |