Métodos para estudiar las contribuciones uterinas al establecimiento del embarazo en un modelo de ratón ovariectomizado
Summary
El establecimiento del embarazo es un proceso dinámico que involucra diafonía compleja entre embriones y úteros. Las contribuciones precisas del entorno uterino materno a estos procesos siguen siendo un área activa de investigación. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para ayudar en el diseño de modelos animales in vivo para abordar estas preguntas de investigación.
Abstract
Para que se establezca el embarazo, un blastocisto viable debe interactuar con éxito con un revestimiento uterino receptivo (endometrio) para facilitar la implantación y la formación de placenta y permitir el embarazo continuo. Las limitaciones para el éxito del embarazo causadas por defectos embrionarios son bien conocidas y se han superado en gran medida en las últimas décadas con el aumento de la fertilización in vitro (FIV) y las tecnologías de reproducción asistida. Hasta ahora, sin embargo, el campo no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo, lo que resulta en un estancamiento de las tasas de éxito de la FIV. Las funciones ováricas y endometriales están estrechamente entrelazadas, ya que las hormonas producidas por el ovario son responsables de la ciclicidad menstrual del endometrio. Como tal, cuando se utilizan modelos de embarazo con roedores, puede ser difícil determinar si un resultado observado se debe a un déficit ovárico o uterino. Para superar esto, se desarrolló un modelo de ratón ovariectomizado con transferencia embrionaria o decidualización artificial para permitir el estudio de las contribuciones específicas uterinas al embarazo. Este artículo proporcionará instrucciones sobre cómo realizar la ovariectomía y ofrecerá información sobre diversas técnicas para suministrar hormonas exógenas para apoyar la decidualización artificial exitosa o el embarazo después de la transferencia de embriones de donantes sanos. Estas técnicas incluyen inyección subcutánea, pellets de liberación lenta y mini bombas osmóticas. Se discutirán las ventajas y desventajas clave de cada método, lo que permitirá a los investigadores elegir el mejor diseño de estudio para su pregunta de investigación específica.
Introduction
Con el creciente uso de tecnologías de reproducción asistida en las últimas décadas, se han superado muchas barreras para la concepción, lo que permite a muchas parejas formar familias a pesar de los problemas de fertilidad1. Los déficits de ovocitos o espermatozoides a menudo se pueden evitar mediante fertilización in vitro o inyección intracitoplasmática de espermatozoides; Sin embargo, las cuestiones relacionadas con el útero y la receptividad endometrial siguen siendo una elusiva “caja negra” de potencial reproductivo2.
El embarazo se establece cuando un embrión de alta calidad interactúa con éxito con un endometrio receptivo (revestimiento uterino). Las posibilidades de éxito del embarazo en cualquier ciclo menstrual son bajas, alrededor del 30%3,4. De las que tienen éxito, solo el 50%-60% avanzan más allá de las 20 semanas de gestación, siendo el fracaso de la implantación responsable del 75% de los embarazos que no llegan a las 20 semanas3. A pesar de estas cifras que se remontan a finales de la década de 1990, el campo aún no ha superado las limitaciones causadas por un endometrio inadecuadamente receptivo. Esto ha resultado en un estancamiento – y a veces disminución – de las tasas de éxito de FIV en los últimos años 5,6.
Las mujeres con infertilidad inexplicable a menudo tienen una ventana desplazada de receptividad o no pueden lograr la receptividad por razones desconocidas. Recientemente, se desarrolló la matriz de receptividad endometrial, que evalúa la expresión de cientos de genes con el propósito de adaptar el momento de la transferencia embrionaria a la ventana de receptividad de un individuo 7,8,9. Sin embargo, el campo todavía carece de una comprensión de la patogénesis de las complicaciones del embarazo que se manifiestan después de que se completa el proceso de implantación.
El sistema reproductor femenino es altamente dinámico y está bajo un estricto control hormonal. El eje hipotalámico-pituitario-gonadal (HPG) controla la liberación de la hormona luteinizante y la hormona foliculoestimulante, que regulan aspectos del ciclo ovárico, incluida la maduración del folículo y la actividad del estrógeno y la progesterona. A su vez, el ciclo menstrual uterino está regulado por estrógenos y progesterona10,11. Por lo tanto, el estudio de los mecanismos biológicos uterinos se complica por la influencia ovárica. Por ejemplo, cuando se estudia cómo las terapias contra el cáncer pueden afectar el útero, puede ser difícil distinguir si cualquier fenotipo uterino observado (como la pérdida del embarazo o la aciclicidad menstrual) es el resultado de un insulto directo al útero o un efecto consecuente del daño a los ovarios.
Para comprender de manera integral la fertilidad, se deben caracterizar las contribuciones uterinas al embarazo. Es importante destacar que esta comprensión debe extenderse más allá de la función uterina bajo control ovárico. Esto no se puede estudiar en humanos; Por lo tanto, a menudo se emplean modelos animales. Como tal, la ovariectomía (OVX) se usa comúnmente para permitir a los investigadores regular los ciclos estrales de roedores (análogos al ciclo menstrual) mediante el suministro de hormonas exógenas. Además, el OVX permite estudiar las respuestas uterinas independientemente de la influencia ovárica12. Sin embargo, si las hormonas no se suministran inmediatamente después de OVX, se producirá un fenotipo de menopausia, que debe ser considerado cuidadosamente por los investigadores.
OVX se utiliza con frecuencia en modelos de roedores 13,14,15,16,17 y es relativamente fácil de realizar después de un entrenamiento adecuado. Los métodos varían dependiendo de si se extirpa el ovario solo o el ovario y el oviducto, así como dependiendo de la edad del animal (los animales adultos en ciclo tienen ovarios más grandes con un cuerpo lúteo visible en su superficie, lo que significa que sus ovarios son más fáciles de visualizar). Del mismo modo, existen muchos métodos de suplementación hormonal, incluidas las inyecciones subcutáneas14, los gránulos de liberación lenta 15, las mini bombas osmóticas18 y el injerto de ovario.
En este artículo, se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo realizar la ovariectomía y preparar tres tipos de suplementos hormonales, incluidas las inyecciones subcutáneas, los gránulos de liberación lenta y las mini bombas osmóticas. Se proporcionan dos protocolos detallados para los criterios de valoración experimentales que se benefician de OVX seguido de la suplementación con hormonas exógenas (transferencia de embriones y decidualización artificial). Este artículo discute las fortalezas y debilidades de cada enfoque con el objetivo de guiar a los investigadores sobre cómo realizar estudios para aislar los impactos en el útero, específicamente en los campos de investigación del embarazo y la fertilidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo realizar OVX y proporcionar hormonas exógenas para estudios centrados en la comprensión de las contribuciones uterinas al embarazo y la fertilidad. Se proporcionan dos protocolos detallados sobre dos aplicaciones experimentales de estos métodos, incluida la realización de la transferencia de embriones y la inducción de la decidualización artificial.
Si bien realizar OVX puede ser un desafío inicialmente, especialmente para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue posible gracias al Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno del Estado de Victoria y al Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud del Gobierno de Australia (NHMRC) IRIISS. Este trabajo fue apoyado por la Subvención de Acceso a la Plataforma de Ciencias de la Salud de la Facultad de Medicina, Enfermería y Ciencias de la Salud de la Universidad de Monash a A.L.W. (Winship-PAG18-0343) para acceder a la Plataforma de Servicios Reproductivos de Monash. A.L.W. cuenta con el apoyo de DECRA financiando DE21010037 del Consejo Australiano de Investigación (ARC). J.N.H. y L.R.A. cuentan con el apoyo de una beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia. L.R.A. cuenta con el apoyo de una beca Monash Graduate Excellence. K.J.H. cuenta con el apoyo de una beca ARC Future FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
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