Ex Vivo Экспансия и генетические манипуляции с гемопоэтическими стволовыми клетками мыши в культурах на основе поливинилового спирта
Summary
Здесь представлен протокол инициирования, поддержания и анализа культур гемопоэтических стволовых клеток мыши с использованием экспансии на основе поливинилового спирта ex vivo , а также методы генетического манипулирования ими с помощью лентивирусной трансдукции и электропорации.
Abstract
Самообновляющиеся мультипотентные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) являются важным типом клеток из-за их способности поддерживать кроветворение на протяжении всей жизни и восстанавливать всю систему крови после трансплантации. ГСК клинически используются в терапии трансплантации стволовых клеток, которая представляет собой лечебное лечение целого ряда заболеваний крови. Существует значительный интерес как к пониманию механизмов, регулирующих активность ГСК и кроветворение, так и к разработке новых методов лечения на основе ГСК. Тем не менее, стабильная культура и экспансия ГСК ex vivo были основным препятствием при изучении этих стволовых клеток в управляемой системе ex vivo . Недавно мы разработали культуральную систему на основе поливинилового спирта, которая может поддерживать долгосрочное и крупномасштабное распространение трансплантируемых ГСК мыши и методов их генетического редактирования. Этот протокол описывает методы культивирования и генетического манипулирования ГСК мыши с помощью электропорации и лентивирусной трансдукции. Ожидается, что этот протокол будет полезен широкому кругу экспериментальных гематологов, интересующихся биологией ГСК и кроветворением.
Introduction
Кроветворная система поддерживает ряд важных процессов у млекопитающих, от снабжения кислородом до борьбы с патогенами, с помощью специализированных типов клеток крови и иммунных клеток. Непрерывная выработка крови (кроветворение) необходима для поддержания гомеостаза системы крови, который поддерживается гемопоэтическими стволовыми клетками и клетками-предшественниками (HSPC)1. Самой примитивной кроветворной клеткой является гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК), обладающая уникальными способностями к самообновлению и многолинейной дифференцировке 2,3. Это редкая клеточная популяция, в основном обнаруженная во взрослом костном мозге4, где они встречаются с частотой примерно одна на каждые 30 000 клеток. Считается, что ГСК поддерживают кроветворение на протяжении всей жизни и помогают восстановить кроветворение после гематологического стресса. Эти возможности также позволяют ГСК стабильно восстанавливать всю кроветворную систему после трансплантации облученному реципиенту5. Это представляет собой функциональное определение ГСК, а также формирует научную основу для трансплантационной терапии ГСК, лечебного лечения ряда заболеваний крови и иммунитета6. По этим причинам ГСК являются основным направлением экспериментальной гематологии.
Несмотря на большое внимание к исследованиям, по-прежнему сложно стабильно расширять HSC ex vivo7. Недавно мы разработали первую долгосрочную систему культивирования ex vivo для мышей HSC8. Этот подход может расширить трансплантируемые ГСК в 234-899 раз за 4-недельную культуру. По сравнению с альтернативными подходами, основным изменением в протоколе стало удаление сывороточного альбумина и замена его синтетическим полимером. Поливиниловый спирт (ПВС) был идентифицирован как оптимальный полимер для культурГСК мышей 8, который в настоящее время также используется для культивирования других типов гемопоэтических клеток9. Однако недавно был идентифицирован другой полимер под названием Soluplus (сополимер трансплантата поливинилкапролактамацетата и полиэтиленгликоля), который, по-видимому, улучшает клональное расширениеГСК 10. До использования полимеров использовали сывороточный альбумин в форме эмбриональной бычьей сыворотки, бычьего сывороточного альбумина фракции V или рекомбинантного сывороточного альбумина, но они имели ограниченную поддержку экспансии ГСК и поддерживали только краткосрочную (~ 1 неделю) культуру ex vivo 7. Однако следует отметить, что протоколы культивирования ГСК, которые сохраняют ГСК в состоянии покоя, могут поддерживать более длительное время культивирования ex vivo 11,12.
По сравнению с другими методами культивирования, основным преимуществом культур на основе ПВА является количество клеток, которые могут быть сгенерированы, и продолжительность времени, в течение которого протокол может использоваться для отслеживания ГСК ex vivo. Это преодолевает несколько барьеров в области экспериментальной гематологии, таких как низкое количество ГСК, выделяемых на мышь (всего несколько тысяч), и сложность отслеживания ГСК с течением времени in vivo. Однако важно помнить, что эти культуры стимулируют пролиферацию ГСК, в то время как пул ГСК in vivo преимущественно находится в состоянии покоя в устойчивом состоянии13. Кроме того, хотя культуры являются селективными в отношении ГСК, дополнительные типы клеток накапливаются вместе с культурами с течением времени, и трансплантируемые ГСК представляют собой примерно одну из 34 клеток через 1 месяц. Миелоидные гемопоэтические клетки-предшественники, по-видимому, являются основным контаминирующим типом клеток в этих культурах ГСК8. Тем не менее, мы можем использовать эти культуры для обогащения ГСК из гетерогенных клеточных популяций (например, c-Kit+ HSPCs14 костного мозга). Он также поддерживает трансдукцию или электропорацию ГСК для генетических манипуляций14,15,16. Чтобы помочь идентифицировать ГСК из гетерогенной культивируемой популяции HSPC, CD201 (EPCR) недавно был идентифицирован как полезный маркер ex vivo HSC 10,17,18, при этом трансплантируемые ГСК ограничены фракцией CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage–.
В этом протоколе описываются методы инициирования, поддержания и оценки культур экспансии ГСК мышей на основе ПВА, а также протоколы генетических манипуляций в этих культурах с использованием электропорации или трансдукции лентивирусного вектора. Ожидается, что эти методы будут полезны для целого ряда экспериментальных гематологов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы надеемся, что этот протокол обеспечит полезный подход к изучению биологии ГСК, кроветворения и гематологии в целом. С момента первоначальной разработки метода культивирования на основе ПВА для FACS-очищенных ГСК8 этот метод был расширен. Например, было показано, что метод …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Центр проточной цитометрии WIMM за доступ к проточной цитометрии и Центр скрининга вирусов WIMM за генерацию лентивирусного вектора. Эта работа финансировалась Фондом лейкемии Кей Кендалл и Советом по медицинским исследованиям Великобритании.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
