Ex vivo Expansion und genetische Manipulation von hämatopoetischen Stammzellen der Maus in Kulturen auf Polyvinylalkoholbasis
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Analyse hämatopoetischer Stammzellkulturen der Maus unter Verwendung von ex vivo Polyvinylalkohol-basierter Expansion sowie Methoden zur genetischen Manipulation dieser Zellen durch lentivirale Transduktion und Elektroporation vorgestellt.
Abstract
Selbsterneuernde multipotente hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind aufgrund ihrer Fähigkeit, die Hämatopoese ein Leben lang zu unterstützen und das gesamte Blutsystem nach einer Transplantation zu rekonstituieren, ein wichtiger Zelltyp. HSZ werden klinisch in Stammzelltransplantationstherapien eingesetzt, die eine kurative Behandlung für eine Reihe von Blutkrankheiten darstellen. Es besteht ein großes Interesse sowohl am Verständnis der Mechanismen, die die HSZ-Aktivität und Hämatopoese regulieren, als auch an der Entwicklung neuer HSZ-basierter Therapien. Die stabile Kultivierung und Expansion von HSCs ex vivo war jedoch ein großes Hindernis bei der Untersuchung dieser Stammzellen in einem handhabbaren ex vivo System. Wir haben kürzlich ein auf Polyvinylalkohol basierendes Kultursystem entwickelt, das die langfristige und großflächige Expansion von transplantierbaren Maus-HSCs und Methoden zu deren genetischer Editierung unterstützen kann. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung und genetischen Manipulation von Maus-HSCs durch Elektroporation und lentivirale Transduktion. Es wird erwartet, dass dieses Protokoll für ein breites Spektrum von experimentellen Hämatologen nützlich sein wird, die sich für HSZ-Biologie und Hämatopoese interessieren.
Introduction
Das hämatopoetische System unterstützt eine Reihe essentieller Prozesse bei Säugetieren, von der Sauerstoffversorgung über die Bekämpfung von Krankheitserregern bis hin zu spezialisierten Blut- und Immunzelltypen. Eine kontinuierliche Blutproduktion (Hämatopoese) ist erforderlich, um die Homöostase des Blutsystems zu unterstützen, die von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) aufrechterhalten wird1. Die primitivste hämatopoetische Zelle ist die hämatopoetische Stammzelle (HSC), die über einzigartige Fähigkeiten zur Selbsterneuerung und Multilineage-Differenzierung verfügt 2,3. Dabei handelt es sich um eine seltene Zellpopulation, die vor allem im adulten Knochenmark4 vorkommt, wo sie mit einer Häufigkeit von nur etwa einer von 30.000 Zellen vorkommt. Es wird angenommen, dass HSZ die lebenslange Hämatopoese unterstützen und helfen, die Hämatopoese nach hämatologischem Stress wiederherzustellen. Diese Kapazitäten ermöglichen es HSZ auch, das gesamte hämatopoetische System nach der Transplantation in einen bestrahlten Empfänger stabil zu rekonstituieren5. Dies stellt die funktionelle Definition einer HSZ dar und bildet auch die wissenschaftliche Grundlage für die HSZ-Transplantationstherapie, eine kurative Behandlung einer Reihe von Blut- und Immunerkrankungen6. Aus diesen Gründen sind HSZ ein wichtiger Schwerpunkt der experimentellen Hämatologie.
Trotz eines großen Forschungsschwerpunkts ist es nach wie vor eine Herausforderung, HSCs ex vivo stabil zu erweitern 7. Vor kurzem haben wir das erste langfristige ex vivo Expansionskultursystem für Maus-HSCs8 entwickelt. Der Ansatz kann transplantierbare HSZ über eine 4-wöchige Kultur um das 234- bis 899-fache erweitern. Im Vergleich zu alternativen Ansätzen bestand die wesentliche Änderung des Protokolls darin, dass Serumalbumin entfernt und durch ein synthetisches Polymer ersetzt wurde. Polyvinylalkohol (PVA) wurde als optimales Polymer für die HSC-Kulturender Maus identifiziert 8, das nun auch zur Kultivierung anderer hämatopoetischer Zelltypen9 verwendet wurde. Kürzlich wurde jedoch auch ein anderes Polymer namens Soluplus (ein Polyvinylcaprolactam-acetat-Polyethylenglykol-Pfropfcopolymer) identifiziert, das die klonale HSC-Expansion zu verbessernscheint 10. Vor der Verwendung von Polymeren wurde Serumalbumin in Form von fötalem Kälberserum, Rinderserumalbuminfraktion V oder rekombinantem Serumalbumin verwendet, die jedoch nur eine begrenzte Unterstützung für die HSC-Expansion boten und nur eine kurzfristige (~1 Woche) ex vivo Kultur unterstützten7. Es sollte jedoch beachtet werden, dass HSC-Kulturprotokolle, die HSCs in einem Ruhezustand halten, eine längere ex vivo Kulturzeit unterstützen können11,12.
Im Vergleich zu anderen Kulturmethoden ist ein großer Vorteil von PVA-basierten Kulturen die Anzahl der Zellen, die erzeugt werden können, und die Zeitspanne, in der das Protokoll verwendet werden kann, um HSZ ex vivo zu verfolgen. Dies überwindet mehrere Barrieren auf dem Gebiet der experimentellen Hämatologie, wie z.B. die geringe Anzahl von HSCs, die pro Maus isoliert werden können (nur einige Tausend) und die Schwierigkeit, HSCs über die Zeit in vivo zu verfolgen. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Kulturen die HSC-Proliferation stimulieren, während der In-vivo-HSC-Pool in einem stationären Zustand überwiegend ruht13. Obwohl die Kulturen selektiv für HSCs sind, reichern sich im Laufe der Zeit zusätzliche Zelltypen mit den Kulturen an, und transplantierbare HSCs machen nach 1 Monat nur etwa eine von 34 Zellen aus. Myeloische hämatopoetische Vorläuferzellen scheinen der wichtigste kontaminierende Zelltyp in diesen HSC-Kulturen zu sein8. Nichtsdestotrotz können wir diese Kulturen zur Anreicherung für HSCs aus heterogenen Zellpopulationen (z.B. c-Kit+ Knochenmark-HSPCs14) verwenden. Es unterstützt auch die Transduktion oder Elektroporation von HSCs für die genetische Manipulation14,15,16. Um die Identifizierung von HSCs aus der heterogen kultivierten HSPC-Population zu erleichtern, wurde CD201 (EPCR) kürzlich als nützlicher ex vivo HSC-Marker10,17,18 identifiziert, wobei transplantierbare HSCs auf die CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage– Fraktion beschränkt sind.
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Initiierung, Aufrechterhaltung und Bewertung von PVA-basierten HSC-Expansionskulturen der Maus sowie Protokolle zur genetischen Manipulation innerhalb dieser Kulturen mittels Elektroporation oder lentiviraler Vektortransduktion. Es wird erwartet, dass diese Methoden für eine Reihe von experimentellen Hämatologen nützlich sein werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir hoffen, dass dieses Protokoll einen nützlichen Ansatz zur Untersuchung der HSZ-Biologie, Hämatopoese und Hämatologie im Allgemeinen bietet. Seit der Erstentwicklung der PVA-basierten Kulturmethode für FACS-gereinigte HSCs8 wurde die Methode erweitert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Methode mit c-Kit, angereichert mit Knochenmark, und mit negativ oberflächengeladenen Platten14 funktioniert. Seine Kompatibilität mit Transduktion und Elektroporation wurde eb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem WIMM Flow Cytometry Core für den Zugang zur Durchflusszytometrie und dem WIMM Virus Screening Core für die Generierung lentiviraler Vektoren. Diese Arbeit wurde vom Kay Kendall Leukaemia Fund und dem UK Medical Research Council finanziert.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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