Ex Vivo Espansione e manipolazione genetica di cellule staminali ematopoietiche di topo in colture a base di alcol polivinilico
Summary
Presentato qui è un protocollo per avviare, mantenere e analizzare colture di cellule staminali ematopoietiche di topo utilizzando l’espansione ex vivo a base di alcol polivinilico, nonché metodi per manipolarle geneticamente mediante trasduzione lentivirale ed elettroporazione.
Abstract
Le cellule staminali ematopoietiche multipotenti (HSC) autorinnovanti sono un tipo di cellula importante grazie alla loro capacità di sostenere l’ematopoiesi per tutta la vita e ricostituire l’intero sistema sanguigno dopo il trapianto. Le HSC sono utilizzate clinicamente nelle terapie di trapianto di cellule staminali, che rappresentano un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue. C’è un notevole interesse sia nella comprensione dei meccanismi che regolano l’attività delle HSC e l’emopoiesi, sia nello sviluppo di nuove terapie basate sulle HSC. Tuttavia, la coltura stabile e l’espansione delle HSC ex vivo è stata una barriera importante nello studio di queste cellule staminali in un sistema ex vivo trattabile. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema di coltura a base di alcol polivinilico in grado di supportare l’espansione a lungo termine e su larga scala delle HSC di topo trapiantabili e dei metodi per modificarle geneticamente. Questo protocollo descrive i metodi per coltivare e manipolare geneticamente le HSC del topo tramite elettroporazione e trasduzione lentivirale. Questo protocollo dovrebbe essere utile a una vasta gamma di ematologi sperimentali interessati alla biologia delle HSC e all’emopoiesi.
Introduction
Il sistema ematopoietico supporta una serie di processi essenziali nei mammiferi, dall’apporto di ossigeno alla lotta contro gli agenti patogeni, attraverso tipi specializzati di cellule del sangue e immunitarie. La produzione continua di sangue (emopoiesi) è necessaria per sostenere l’omeostasi del sistema sanguigno, che è sostenuta dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC)1. La cellula ematopoietica più primitiva è la cellula staminale ematopoietica (HSC), che ha capacità uniche di auto-rinnovamento e differenziazione multilineare 2,3. Questa è una popolazione di cellule rare, che si trova principalmente nel midollo osseo adulto4, dove si verificano ad una frequenza di circa una ogni 30.000 cellule. Si ritiene che le HSC supportino l’ematopoiesi per tutta la vita e contribuiscano a ristabilire l’ematopoiesi dopo stress ematologico. Queste capacità consentono inoltre alle HSC di ricostituire stabilmente l’intero sistema ematopoietico dopo il trapianto in un ricevente irradiato5. Questo rappresenta la definizione funzionale di una HSC e costituisce anche la base scientifica per la terapia di trapianto di HSC, un trattamento curativo per una serie di malattie del sangue e immunitarie6. Per questi motivi, le HSC sono un obiettivo importante dell’ematologia sperimentale.
Nonostante un grande focus di ricerca, è rimasto difficile espandere stabilmente le HSC ex vivo7. Recentemente abbiamo sviluppato il primo sistema di coltura di espansione ex vivo a lungo termine per HSC di topo8. L’approccio può espandere le HSC trapiantabili di 234-899 volte in una coltura di 4 settimane. Rispetto agli approcci alternativi, il principale cambiamento nel protocollo è stata la rimozione dell’albumina sierica e la sua sostituzione con un polimero sintetico. L’alcol polivinilico (PVA) è stato identificato come un polimero ottimale per le colture HSC di topo8, che ora è stato utilizzato anche per la coltura di altri tipi di cellule ematopoietiche9. Tuttavia, è stato recentemente identificato anche un altro polimero chiamato Soluplus (un copolimero di innesto di polivinil-caprolattame-acetato-polietilenglicole), che sembra migliorare l’espansione clonale HSC10. Prima dell’uso dei polimeri, venivano utilizzate albumina sierica sotto forma di siero bovino fetale, frazione di albumina sierica bovina V o albumina sierica ricombinante, ma questi avevano un supporto limitato per l’espansione HSC e supportavano solo colture ex vivo a breve termine (~ 1 settimana)7. Tuttavia, va notato che i protocolli di coltura HSC che mantengono le HSC in uno stato quiescente possono supportare un tempo di coltura ex vivo più lungo11,12.
Rispetto ad altri metodi di coltura, uno dei principali vantaggi delle colture basate su PVA è il numero di cellule che possono essere generate e il periodo di tempo in cui il protocollo può essere utilizzato per tracciare le HSC ex vivo. Questo supera diverse barriere nel campo dell’ematologia sperimentale, come il basso numero di HSC isolabili per topo (solo poche migliaia) e la difficoltà di tracciare le HSC nel tempo in vivo. Tuttavia, è importante ricordare che queste colture stimolano la proliferazione delle HSC, mentre il pool di HSC in vivo è prevalentemente quiescente allo stato stazionario13. Inoltre, sebbene le colture siano selettive per le HSC, ulteriori tipi di cellule si accumulano con le colture nel tempo e le HSC trapiantabili rappresentano solo circa una su 34 cellule dopo 1 mese. Le cellule progenitrici ematopoietiche mieloidi sembrano essere il principale tipo di cellula contaminante in queste colture di HSC8. Tuttavia, possiamo usare queste colture per arricchire per HSC da popolazioni cellulari eterogenee (ad esempio, c-Kit+ midollo osseo HSPCs14). Supporta anche la trasduzione o l’elettroporazione delle HSC per la manipolazione genetica14,15,16. Per aiutare a identificare le HSC dalla popolazione eterogenea di HSPC, CD201 (EPCR) è stato recentemente identificato come un utile marcatore HSC ex vivo 10,17,18, con HSC trapiantabili limitate alla frazione CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage–.
Questo protocollo descrive i metodi per avviare, mantenere e valutare colture di espansione HSC di topo basate su PVA, nonché protocolli per la manipolazione genetica all’interno di queste colture utilizzando l’elettroporazione o la trasduzione del vettore lentivirale. Questi metodi dovrebbero essere utili per una serie di ematologi sperimentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Speriamo che questo protocollo fornisca un approccio utile per indagare la biologia delle HSC, l’ematopoiesi e l’ematologia più in generale. Dopo lo sviluppo iniziale del metodo di coltura basato su PVA per le HSC purificate FACS8, il metodo è stato esteso. Ad esempio, il metodo ha dimostrato di funzionare con c-Kit arricchito con midollo osseo e con piastre caricate superficialmente negative14. La sua compatibilità con la trasduzione e l’elettroporazione è stata dimost…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il WIMM Flow Cytometry Core per l’accesso alla citometria a flusso e il WIMM Virus Screening Core per la generazione di vettori lentivirali. Questo lavoro è stato finanziato dal Kay Kendall Leukaemia Fund e dal Medical Research Council del Regno Unito.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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