Ex Vivo (생체 외 ) 폴리비닐 알코올 기반 배양에서 마우스 조혈 줄기 세포의 확장 및 유전자 조작
Summary
여기에 제시된 것은 생체 외 폴리비닐 알코올 기반 확장을 사용하여 마우스 조혈 줄기 세포 배양을 시작, 유지 및 분석하는 프로토콜과 렌티바이러스 형질도입 및 전기천공을 통해 유전적으로 조작하는 방법입니다.
Abstract
자가 재생 다능성 조혈 줄기 세포(HSC)는 평생 동안 조혈을 지원하고 이식 후 전체 혈액 시스템을 재구성하는 능력으로 인해 중요한 세포 유형입니다. HSC는 다양한 혈액 질환에 대한 근치적 치료를 나타내는 줄기 세포 이식 요법에 임상적으로 사용됩니다. HSC 활동과 조혈을 조절하는 메커니즘을 이해하고 새로운 HSC 기반 치료법을 개발하는 데 상당한 관심이 있습니다. 그러나 생체 외에서 HSC의 안정적인 배양과 확장은 다루기 쉬운 생체 외 시스템에서 이러한 줄기 세포를 연구하는 데 주요 장벽이었습니다. 우리는 최근 이식 가능한 마우스 HSC의 장기 및 대규모 확장을 지원할 수 있는 폴리비닐알코올 기반 배양 시스템과 이를 유전자 편집하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 통해 마우스 HSC를 배양하고 유전적으로 조작하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 HSC 생물학 및 조혈에 관심이 있는 광범위한 실험적 혈액학자에게 유용할 것으로 예상됩니다.
Introduction
조혈 시스템은 산소 공급에서 병원균 퇴치, 특수 혈액 및 면역 세포 유형을 통해 포유류의 다양한 필수 과정을 지원합니다. 지속적인 혈액 생산(조혈)은 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에 의해 유지되는 혈액 시스템 항상성을 지원하는 데 필요합니다1. 가장 원시적인 조혈 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)로, 자가 재생 및 다계통 분화를 위한 독특한 능력을 가지고 있습니다 2,3. 이 세포집단은 주로 성인 골수에서 발견되는 희귀한 세포집단이다4, 30,000개 세포마다 약 1개의 빈도로 발생한다. HSC는 평생 조혈을 지원하고 혈액학적 스트레스 후 조혈을 재건하는 데 도움이 되는 것으로 생각됩니다. 이러한 능력은 또한 HSC가 방사선 조사를 받은 수용자에게 이식된 후 전체 조혈 시스템을 안정적으로 재구성할 수 있도록 한다5. 이는 HSC의 기능적 정의를 나타내며 다양한 혈액 및 면역 질환에 대한 치료 치료인 HSC 이식 요법의 과학적 근거를 형성합니다6. 이러한 이유로 HSC는 실험적 혈액학의 주요 초점입니다.
많은 연구에도 불구하고 생체 외 HSC를 안정적으로 확장하는 것은 여전히 어려운 과제입니다 7. 우리는 최근 마우스 HSC를 위한 최초의 장기 생체 외 확장 배양 시스템을 개발했습니다8. 이 접근법은 4주간의 배양 기간 동안 이식 가능한 HSC를 234-899배까지 확장할 수 있습니다. 대체 접근법과 비교하여 프로토콜의 주요 변경 사항은 혈청 알부민을 제거하고 합성 고분자로 대체하는 것이었습니다. 폴리비닐알코올(Polyvinyl alcohol, PVA)은 마우스 HSC 배양을 위한 최적의 고분자로 확인되었다8, 현재는 다른 조혈 세포 유형9 배양에도 사용되고 있다. 그러나, Soluplus(폴리비닐 카프로락탐-아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그라프트 공중합체)라고 불리는 또 다른 중합체도 최근에 확인되었는데, 이는 클론 HSC 확장을 개선하는 것으로 보인다10. 중합체를 사용하기 전에는 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민 분획 V 또는 재조합 혈청 알부민 형태의 혈청 알부민이 사용되었으나, 이들은 HSC 확장에 대한 지원이 제한적이었고 단기간(~1주) 생체 외 배양만 지원했다7. 그러나, HSC를 정지 상태로 유지하는 HSC 배양 프로토콜은 더 긴 생체외 배양 시간을 지원할 수 있다는 점에 유의해야 한다(11,12).
다른 배양 방법과 비교할 때 PVA 기반 배양의 주요 이점은 생성할 수 있는 세포의 수와 프로토콜을 사용하여 생체 외에서 HSC를 추적할 수 있는 시간입니다. 이는 마우스당 분리할 수 있는 HSC의 수가 적고(수천 개에 불과) 생체 내에서 시간 경과에 따른 HSC를 추적하기 어렵다는 것과 같은 실험적 혈액학 분야의 여러 장벽을 극복합니다. 그러나, 이들 배양물은 HSC 증식을 자극하는 반면, 생체내 HSC 풀은 정상 상태에서 주로 정지 상태라는 것을 기억하는 것이 중요하다13. 또한 배양은 HSC에 대해 선택적이지만 시간이 지남에 따라 추가 세포 유형이 배양과 함께 축적되며 이식 가능한 HSC는 1개월 후 34개 세포 중 약 1개만 나타냅니다. 골수성 조혈 전구세포는 이들 HSC 배양물에서 주요 오염 세포 유형인 것으로 나타난다8. 그럼에도 불구하고 우리는 이러한 배양을 사용하여 이종 세포 집단(예: c-Kit+ 골수 HSPC에서 HSC를 풍부하게 할 수 있습니다14). 또한 유전자 조작을 위한 HSC의 형질도입 또는 전기천공을 지원합니다14,15,16. 이질적인 배양된 HSPC 집단에서 HSC를 식별하는 데 도움이 되도록 CD201(EPCR)은 최근 유용한 생체 외 HSC 마커10,17,18로 확인되었으며 이식 가능한 HSC는 CD201+CD150+c-Kit+Sca1+Lineage– 분획으로 제한됩니다.
이 프로토콜은 PVA 기반 마우스 HSC 확장 배양을 시작, 유지 및 평가하는 방법과 전기천공 또는 렌티바이러스 벡터 형질도입을 사용하여 이러한 배양 내에서 유전자 조작을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 방법은 다양한 실험적 혈액학자에게 유용할 것으로 예상됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 이 프로토콜이 HSC 생물학, 조혈 및 혈액학을 보다 일반적으로 조사하는 데 유용한 접근 방식을 제공하기를 바랍니다. FACS 정제 HSCs에 대한 PVA 기반 배양 방법의 초기 개발 8 이후, 이 방법은 확장되었다. 예를 들어, 상기 방법은 골수가 풍부한 c-Kit 및 음극 표면 대전 플레이트(14)와 함께 작동하는 것으로 나타났다. 형질도입 및 전기천공법과의 상용성도 입…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
유세포 분석에 대한 WIMM 유세포 분석 코어(Flow Cytometry Core)와 렌티바이러스 벡터 생성을 위한 WIMM 바이러스 스크리닝 코어(WIMM Virus Screening Core)에 감사드립니다. 이 연구는 Kay Kendall Leukaemia Fund와 UK Medical Research Council의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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