إكس فيفو التوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران في الثقافات القائمة على كحول البولي فينيل
Summary
يظهر هنا بروتوكول لبدء وصيانة وتحليل مزارع الخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران باستخدام التوسع القائم على كحول البولي فينيل خارج الجسم الحي ، بالإضافة إلى طرق معالجتها وراثيا عن طريق نقل الفيروسات العدسية والتثقيب الكهربائي.
Abstract
تعد الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات ذاتية التجديد (HSCs) نوعا مهما من الخلايا نظرا لقدراتها على دعم تكون الدم طوال الحياة وإعادة تكوين نظام الدم بأكمله بعد الزرع. تستخدم HSCs سريريا في علاجات زرع الخلايا الجذعية ، والتي تمثل علاجا شافيا لمجموعة من أمراض الدم. هناك اهتمام كبير بكل من فهم الآليات التي تنظم نشاط HSC وتكون الدم ، وتطوير علاجات جديدة قائمة على HSC. ومع ذلك ، فإن الثقافة المستقرة والتوسع في HSCs خارج الجسم الحي كان عائقا رئيسيا في دراسة هذه الخلايا الجذعية في نظام خارج الجسم الحي القابل للتتبع. لقد طورنا مؤخرا نظام استزراع قائم على كحول البولي فينيل يمكنه دعم التوسع طويل الأجل وواسع النطاق في HSCs للفأر القابلة للزرع وطرق تحريرها وراثيا. يصف هذا البروتوكول طرق زراعة ومعالجة HSCs للفأر وراثيا عن طريق التثقيب الكهربائي ونقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول مفيدا لمجموعة واسعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبية المهتمين ببيولوجيا HSC وتكون الدم.
Introduction
يدعم نظام المكونة للدم مجموعة من العمليات الأساسية في الثدييات ، من إمدادات الأكسجين إلى مكافحة مسببات الأمراض ، من خلال أنواع الدم والخلايا المناعية المتخصصة. يلزم إنتاج الدم المستمر (تكون الدم) لدعم توازن نظام الدم ، والذي تدعمه الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs)1. الخلية المكونة للدم الأكثر بدائية هي الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) ، والتي تتمتع بقدرات فريدة على التجديد الذاتي والتمايز متعدد السلالات 2,3. هذه مجموعة خلايا نادرة ، توجد بشكل رئيسي في نخاع العظمالبالغ 4 ، حيث تحدث بتردد واحد فقط لكل 30000 خلية. يعتقد أن HSCs تدعم تكون الدم مدى الحياة وتساعد على إعادة تكوين الدم بعد الإجهاد الدموي. تسمح هذه القدرات أيضا ل HSCs بإعادة تكوين نظام المكونة للدم بالكامل بثبات بعد الزرع في متلقي مشع5. يمثل هذا التعريف الوظيفي ل HSC ويشكل أيضا الأساس العلمي لعلاج زرع HSC ، وهو علاج علاجي لمجموعة من أمراض الدم والمناعة6. لهذه الأسباب ، HSCs هي محور رئيسي لأمراض الدم التجريبية.
على الرغم من التركيز الكبير للبحث ، فقد ظل من الصعب توسيع HSCs خارج الجسمالحي 7 بثبات. لقد طورنا مؤخرا أول نظام استزراع توسع خارج الجسم الحي طويل الأجل للفأر HSCs8. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى توسيع HSCs القابلة للزرع بمقدار 234-899 ضعفا على مدار 4 أسابيع. بالمقارنة مع النهج البديلة ، كان التغيير الرئيسي في البروتوكول هو إزالة ألبومين المصل واستبداله ببوليمر صناعي. تم تحديد كحول البولي فينيل (PVA) كبوليمر مثالي لمزارع HSC للفأر8 ، والذي تم استخدامه الآن أيضا لاستزراع أنواع الخلايا المكونة للدمالأخرى 9. ومع ذلك ، تم مؤخرا تحديد بوليمر آخر يسمى Soluplus (بوليمر مشترك من البولي فينيل كابرولاكتام – أسيتات – بولي إيثيلين جلايكول) ، والذي يبدو أنه يحسن توسع HSC النسيلي10. قبل استخدام البوليمرات ، تم استخدام ألبومين المصل في شكل مصل بقري جنيني ، أو جزء ألبومين مصل الأبقار V ، أو ألبومين مصل المؤتلف ، ولكن كان لها دعم محدود لتوسيع HSC ودعمت فقط على المدى القصير (~ 1 أسبوع) ثقافة خارج الجسم الحي 7. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكولات ثقافة HSC التي تحتفظ ب HSCs في حالة هادئة يمكن أن تدعم وقتا أطول للثقافة خارج الجسم الحي 11,12.
بالمقارنة مع طرق الاستزراع الأخرى ، فإن الميزة الرئيسية للثقافات القائمة على PVA هي عدد الخلايا التي يمكن إنشاؤها وطول الوقت الذي يمكن فيه استخدام البروتوكول لتتبع HSCs خارج الجسم الحي. هذا يتغلب على العديد من الحواجز في مجال أمراض الدم التجريبية ، مثل انخفاض أعداد HSCs المعزولة لكل فأر (بضعة آلاف فقط) وصعوبة تتبع HSCs بمرور الوقت في الجسم الحي. ومع ذلك ، من المهم أن نتذكر أن هذه الثقافات تحفز انتشار HSC ، في حين أن تجمع HSC في الجسم الحي هو في الغالب هادئ في حالة مستقرة13. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن الثقافات انتقائية ل HSCs ، إلا أن أنواع الخلايا الإضافية تتراكم مع الثقافات بمرور الوقت ، ولا تمثل HSCs القابلة للزرع سوى خلية واحدة فقط من كل 34 خلية بعد شهر 1. يبدو أن الخلايا السلفية المكونة للدم النخاعية هي نوع الخلايا الملوثة الرئيسية في ثقافات HSCهذه 8. ومع ذلك ، يمكننا استخدام هذه الثقافات لإثراء HSCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة (على سبيل المثال ، c-Kit + نخاع العظم HSPCs14). كما أنه يدعم النقل أو التثقيب الكهربائي ل HSCs للتلاعب الجيني14،15،16. للمساعدة في تحديد HSCs من مجموعات HSPC المستزرعة غير المتجانسة ، تم تحديد CD201 (EPCR) مؤخرا كعلامة HSC مفيدة خارج الجسم الحي 10،17،18 ، مع HSCs القابلة للزرع تقتصر على CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage– جزء.
يصف هذا البروتوكول طرقا لبدء وصيانة وتقييم ثقافات توسع HSC للفأر القائم على PVA ، بالإضافة إلى بروتوكولات التلاعب الجيني داخل هذه الثقافات باستخدام التثقيب الكهربائي أو نقل ناقل الفيروسات العدسية. من المتوقع أن تكون هذه الطرق مفيدة لمجموعة من أخصائيي أمراض الدم التجريبيين.
Protocol
Representative Results
Discussion
نأمل أن يوفر هذا البروتوكول نهجا مفيدا للتحقيق في بيولوجيا HSC وتكون الدم وأمراض الدم بشكل عام. منذ التطوير الأولي لطريقة الاستزراع القائمة على PVA لHSCs 8 المنقاة من FACS ، تم توسيع الطريقة. على سبيل المثال ، ثبت أن الطريقة تعمل مع c-Kit المخصب بنخاع العظام ومع الألواح المشحونة بالسطح<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر نواة قياس التدفق الخلوي WIMM للوصول إلى قياس التدفق الخلوي ، ونواة فحص الفيروسات WIMM لتوليد ناقلات الفيروسات العدسية. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق كاي كيندال لسرطان الدم ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة.
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
- Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
- Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
- Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
- Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
- Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
- Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
- Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).
- Aal Wilson, ., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).
- Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
- Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).
- Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
- Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
- Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
- Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
- Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).
