एक्स वीवो पॉलीविनाइल अल्कोहल-आधारित संस्कृतियों में माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल का विस्तार और आनुवंशिक हेरफेर
Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो पूर्व विवो पॉलीविनाइल अल्कोहल-आधारित विस्तार का उपयोग करके माउस हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल संस्कृतियों को शुरू करने, बनाए रखने और विश्लेषण करने के लिए है, साथ ही साथ लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीके भी हैं।
Abstract
स्व-नवीनीकृत मल्टीपोटेंट हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) जीवन भर हेमटोपोइजिस का समर्थन करने और प्रत्यारोपण के बाद पूरे रक्त प्रणाली को पुनर्गठित करने की उनकी क्षमताओं के कारण एक महत्वपूर्ण सेल प्रकार हैं। एचएससी का उपयोग स्टेम सेल प्रत्यारोपण उपचारों में चिकित्सकीय रूप से किया जाता है, जो रक्त रोगों की एक श्रृंखला के लिए उपचारात्मक उपचार का प्रतिनिधित्व करते हैं। एचएससी गतिविधि और हेमटोपोइजिस को विनियमित करने वाले तंत्र को समझने और नए एचएससी-आधारित उपचार विकसित करने दोनों में पर्याप्त रुचि है। हालांकि, एचएससी एक्स विवो की स्थिर संस्कृति और विस्तार एक वापस लेने योग्य पूर्व विवो प्रणाली में इन स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने में एक प्रमुख बाधा रही है। हमने हाल ही में एक पॉलीविनाइल अल्कोहल-आधारित संस्कृति प्रणाली विकसित की है जो प्रत्यारोपण योग्य माउस एचएससी के दीर्घकालिक और बड़े पैमाने पर विस्तार और आनुवंशिक रूप से उन्हें संपादित करने के तरीकों का समर्थन कर सकती है। यह प्रोटोकॉल इलेक्ट्रोपोरेशन और लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से माउस एचएससी को कल्चर और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीकों का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल एचएससी जीव विज्ञान और हेमटोपोइजिस में रुचि रखने वाले प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजिस्ट की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होने की उम्मीद है।
Introduction
हेमटोपोइएटिक प्रणाली स्तनधारियों में आवश्यक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला का समर्थन करती है, विशेष रक्त और प्रतिरक्षा कोशिका प्रकारों के माध्यम से ऑक्सीजन की आपूर्ति से लेकर रोगजनकों से लड़ने तक। रक्त प्रणाली होमियोस्टैसिस का समर्थन करने के लिए निरंतर रक्त उत्पादन (हेमटोपोइजिस) की आवश्यकता होती है, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) 1 द्वारा बनाए रखा जाता है। सबसे आदिम हेमटोपोइएटिक सेल हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी) है, जिसमें आत्म-नवीकरण और बहुवंशीय भेदभाव 2,3 के लिए अद्वितीय क्षमता है। यह एक दुर्लभ कोशिका आबादी है, जो मुख्य रूप से वयस्क अस्थि मज्जा4 में पाई जाती है, जहां वे हर 30,000 कोशिकाओं में लगभग एक की आवृत्ति पर होते हैं। एचएससी को जीवन भर हेमटोपोइजिस का समर्थन करने और हेमेटोलॉजिकल तनाव के बाद हेमटोपोइजिस को फिर से स्थापित करने में मदद करने के लिए माना जाता है। ये क्षमताएं एचएससी को एक विकिरणित प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपण के बाद पूरे हेमटोपोइएटिक प्रणाली को स्थिर रूप से पुनर्गठित करने की अनुमति देतीहैं। यह एक एचएससी की कार्यात्मक परिभाषा का प्रतिनिधित्व करता है और एचएससी प्रत्यारोपण चिकित्सा के लिए वैज्ञानिक आधार भी बनाता है, रक्त और प्रतिरक्षा रोगों की एक श्रृंखला के लिए एक उपचारात्मक उपचार। इन कारणों से, एचएससी प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजी का एक प्रमुख फोकस हैं।
अनुसंधान के एक बड़े फोकस के बावजूद, एचएससी एक्स विवो7 का विस्तार करना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। हमने हाल ही में माउस एचएससी 8 के लिए पहली दीर्घकालिक पूर्व विवो विस्तार संस्कृति प्रणाली विकसितकी है। यह दृष्टिकोण 4 सप्ताह की संस्कृति में प्रत्यारोपण योग्य एचएससी को 234-899 गुना तक बढ़ा सकता है। वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में, प्रोटोकॉल में प्रमुख परिवर्तन सीरम एल्बुमिन को हटाना और सिंथेटिक बहुलक के साथ इसका प्रतिस्थापन था। पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) को माउस एचएससी संस्कृतियों8 के लिए एक इष्टतम बहुलक के रूप में पहचाना गया था, जिसका उपयोग अब अन्य हेमटोपोइएटिक सेल प्रकार9 को कल्चर करने के लिए भी किया गया है। हालांकि, सोलुप्लस नामक एक अन्य बहुलक (एक पॉलीविनाइल कैप्रोलैक्टम-एसीटेट-पॉलीइथिलीन ग्लाइकोल ग्राफ्ट कॉपोलीमर) की भी हाल ही में पहचान की गई है, जो क्लोनल एचएससी विस्तार10 में सुधार करता प्रतीत होता है। पॉलिमर के उपयोग से पहले, भ्रूण गोजातीय सीरम, गोजातीय सीरम एल्बुमिन अंश वी, या पुनः संयोजक सीरम एल्ब्यूमिन के रूप में सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग किया गया था, लेकिन इनमें एचएससी विस्तार के लिए सीमित समर्थन था और केवल अल्पकालिक (~ 1 सप्ताह) एक्स विवो कल्चर 7 का समर्थनकिया गया था। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचएससी संस्कृति प्रोटोकॉल जो एचएससी को एक क्वीसेंट स्थिति में बनाए रखते हैं, लंबे समय तक विवो संस्कृति समय11,12 का समर्थन कर सकते हैं।
अन्य संस्कृति विधियों की तुलना में, पीवीए-आधारित संस्कृतियों का एक प्रमुख लाभ उन कोशिकाओं की संख्या है जो उत्पन्न हो सकती हैं और प्रोटोकॉल की लंबाई एचएससी एक्स विवो को ट्रैक करने के लिए उपयोग की जा सकती है। यह प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजी के क्षेत्र में कई बाधाओं को दूर करता है, जैसे कि एचएससी की कम संख्या प्रति माउस (केवल कुछ हजार) और विवो में समय के साथ एचएससी को ट्रैक करने में कठिनाई। हालांकि, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि ये संस्कृतियां एचएससी प्रसार को प्रोत्साहित करती हैं, जबकि विवो एचएससी पूल मुख्य रूप से स्थिर अवस्था13 पर होता है। इसके अतिरिक्त, हालांकि संस्कृतियां एचएससी के लिए चयनात्मक हैं, अतिरिक्त सेल प्रकार समय के साथ संस्कृतियों के साथ जमा होते हैं, और प्रत्यारोपण योग्य एचएससी केवल 1 महीने के बाद 34 कोशिकाओं में से लगभग एक का प्रतिनिधित्व करते हैं। माइलॉयड हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं इन एचएससी संस्कृतियों में प्रमुख दूषित सेल प्रकार प्रतीत होतीहैं। फिर भी, हम इन संस्कृतियों का उपयोग विषम सेल आबादी (जैसे, सी-किट + अस्थि मज्जा एचएसपीसी14) से एचएससी के लिए समृद्ध करने के लिए कर सकते हैं। यह आनुवंशिक हेरफेर14,15,16 के लिए एचएससी के पारगमन या इलेक्ट्रोपोरेशन का भी समर्थन करता है। विषम सुसंस्कृत एचएसपीसी आबादी से एचएससी की पहचान करने में मदद करने के लिए, सीडी 201 (ईपीसीआर) को हाल ही में एक उपयोगी पूर्व विवो एचएससी मार्कर10,17,18 के रूप में पहचाना गया है, जिसमें प्रत्यारोपण योग्य एचएससी सीडी 201 + सीडी 150 + सी-किट + एससीए 1 + वंशावली-अंश तक सीमित है।
यह प्रोटोकॉल पीवीए-आधारित माउस एचएससी विस्तार संस्कृतियों को शुरू करने, बनाए रखने और मूल्यांकन करने के तरीकों का वर्णन करता है, साथ ही इलेक्ट्रोपोरेशन या लेंटिवायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन का उपयोग करके इन संस्कृतियों के भीतर आनुवंशिक हेरफेर के लिए प्रोटोकॉल भी बताता है। इन विधियों को प्रयोगात्मक हेमेटोलॉजिस्ट की एक श्रृंखला के लिए उपयोगी होने की उम्मीद है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल एचएससी जीव विज्ञान, हेमटोपोइजिस और हेमेटोलॉजी की जांच के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है। एफएसीएस-शुद्ध एचएससी8 के लिए पीवीए-आधारित संस्कृति विधि के प्र…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फ्लो साइटोमेट्री एक्सेस के लिए डब्ल्यूआईएमएम फ्लो साइटोमेट्री कोर और लेंटिवायरल वेक्टर पीढ़ी के लिए डब्ल्यूआईएमएम वायरस स्क्रीनिंग कोर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को के केंडल ल्यूकेमिया फंड और यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Equipment | |||
| Dissection kit | Fisher Scientific | 12764416 | |
| Hemocytometer | Appleton Woods Ltd | HC002 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| Pestle and mortar | Scientific Laboratory Supplies Limited | X18000 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2317 | |
| 70 μm cell strainer | Corning | 431751 | |
| Kimtech wipes | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | 1081058 | |
| Animal free recombinant mouse stem cell factor | Peprotech | AF-250-03 | |
| Animal free recombinant mouse thrombopoietin | Peprotech | AF-315-14 | |
| Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8) | ThermoFisher | 17-1171-83 | |
| Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8) | Biolegend | 105828 | |
| Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBIND plates, 24-well | Corning | 3337 | negative surface charged |
| CellBIND plates, 96-well | Corning | 3330 | negative surface charged |
| Custom synthetic sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | Custom order | |
| Fetal bovine serum | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| Fibronectin Coated plates, 96-well | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| Phosphate buffered saline | Alfa Aesar | J61196.AP | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| Propidium Iodide | Enzo Life Sciences (UK) Ltd | EXB-0018 | |
| Streptavidin APC/Cy7 | Biolegend | 405208 | |
| Türks’ solution | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
References
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