Dit protocol beschrijft het opzetten en uitvoeren van een micro-respirometriesysteem dat kan worden gebruikt om de fysiologische kenmerken van het koraalholobiont te onderzoeken.
Metabolische activiteit, gedefinieerd als de som van organismale processen waarbij energie betrokken is, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de functie en evolutie van het leven op aarde. Het meten van de stofwisseling van organismen staat daarom centraal bij het verklaren van de fysiologische toestanden van organismen, hun ecologische rol en de impact van veranderingen in het milieu op soorten binnen terrestrische en aquatische ecosystemen. Op koraalriffen zijn metingen van het metabolisme gebruikt om de symbiosewerking tussen koralen en hun obligate algensymbionten (Symbiodiniaceae) te kwantificeren, en om te beoordelen hoe omgevingsstressoren, waaronder klimaatverandering, de gezondheid van koraal zullen beïnvloeden. Ondanks dit belang is er een gebrek aan methoden, en dus gegevens, met betrekking tot metabolische snelheidsmetingen bij koraalnakomelingen, waarschijnlijk vanwege hun kleine omvang. Om deze kloof te dichten, had deze studie tot doel een aangepaste opstelling te ontwikkelen voor het meten van de ademhaling van kleine (millimetergroottebereik) ecologieën van zeedieren. Deze lage kosten en eenvoudige installatie zouden een betere meting van de stofwisseling mogelijk moeten maken. Dit zal essentieel zijn voor toegepast ecologisch onderzoek waarbij gebruik wordt gemaakt van de seksuele productie van koralen voor rifherstel.
Ademhaling is een kritische biologische meting die de algehele metabolische activiteit van een organisme signaleert, maar net als andere kritische eigenschappen (groei) moeilijk te meten is in kleine organismen. Ademhaling kan worden gedefinieerd als de oxidatie van organische moleculen door het gebruik van zuurstof. Dit proces genereert de chemische energie die nodig is voor de cellulaire functie (d.w.z. metabolisme), wat essentieel is voor het overleven van organismen. Als alternatief resulteert anaëroob metabolisme in zuurstofschuld2. Ademhalingsfrequenties kunnen worden bepaald met behulp van optoden die het gebruik (en dus de afname) van de zuurstofconcentratie in de loop van de tijd meten in een gesloten kamer, een praktijk die algemeen bekend staat als respirometrie3. Aangezien de meeste organismen geen zuurstof opslaan, kan de snelheid van het metabolisme worden afgeleid uit de directe correlatie tussen ademhaling en koolstofgebruik. Hierdoor kan de ademhalingsfrequentie worden omgezet in dagelijks koolstofgebruik, wat kritieke metabolische functies zoals groei, voortplanting en het vermogen om metabole homeostase te handhaven informeert in tijden van omgevingsstress 4,5, inclusief hittegolfomstandigheden die over het algemeen leiden tot stress of verbleking bij koralen.
Koraalriffen nemen wereldwijd in een steeds sneller tempo af. Het koraaldier herbergt een consortium van partners (waaronder dinoflagellaat Symbiodiniaceae, schimmels, bacteriën en virussen), gezamenlijk aangeduid als de “holobiont”6. Naarmate de oceaantemperaturen stijgen, staan koralen, en dus koraalriffen, onder toenemende druk om te overleven, aangezien hoge temperaturen leiden tot het verlies van het dinoflagellaat Symbiodiniaceae (hierna symbionten), een fenomeen dat bekend staat als bleking7. Veel voedingsstoffen zijn anders niet beschikbaar voor koralen in oligotrofe tropische wateren, waaronder anorganische stikstof en fosfor8. Om het hoofd te bieden, vormen koralen een obligate voedingssymbiose met hun dinoflagellaatsymbionten (Symbiodiniaceae), die het grootste deel van de voedingsstoffen leveren die de koraalgastheer nodig heeft om te overleven en hun calciumcarbonaatskeletten af te zetten9. Een functionerende symbiose kan worden gekenmerkt door een hoge mate van koolstofdeling tussen partners10,11, en de regulatie van symbiose omvat een dynamische homeostase12.
Tijdens hittestress worden deze dynamische regulatie en communicatie verstoord, wat resulteert in dysbiose en bleken (besproken in referentie13). Metabole metingen, zoals fotosynthese en ademhaling, hebben daarom het potentieel om zowel de gezonde als de ongereguleerde, dysbiotische toestanden van koralen op te helderen, en het nauwkeurig meten van deze processen in de ontogenie is van cruciaal belang voor het begrijpen van het functioneren van organismen. Dit is vooral belangrijk omdat de frequentie en omvang van massale bleekgebeurtenissen toenemen, met het potentieel om veranderingen in het delen van voedingsstoffen van de symbionten te beïnvloeden, waarbij is vastgesteld dat de koolstofoverdracht afneemt naarmate de temperatuurstijgt14. Dit kan te wijten zijn aan gestuurde mechanismen door de symbiont die voedingsstoffen vastlegt of aan hard-fysiologische afwegingen (verhoogde thermische tolerantie maar een afname van de overleving van de gastheer 15,16,17). Verstoringen in symbiose kunnen het gevolg zijn van zowel de symbiont als de gastheer, hoewel een leidende factor waarschijnlijk het cellulaire disfunctioneren van de symbiont is18. Stress veroorzaakt door stijgingen van de zeewatertemperatuur destabiliseert deze symbiose echter; Het delen van koolstof van symbiont tot gastheer wordt verminderd met19,20 en verhongering van het koraal kan het gevolg zijn. Dit kan worden weerspiegeld in verminderde lipiden- en koolhydraatvoorraden in koralen als gevolg van een verhoogd gebruik van de gastheer (“verhoogd katabolisme van vaste koolstof”), waarschijnlijk als gevolg van verminderd delen door symbionten11. Naast de bijdrage van fotosynthese en ademhaling van de symbionten van de koralen, is de ademhaling van het koraaldier een belangrijke maatstaf om de gezondheid van het koraal, de effecten van verbleking en de uitwisseling van voedingsstoffen tussen deze partners en de groei van de holobiont, een fenotype dat relevant is voor het overleven van veranderingen in het milieute begrijpen 8,21,22. Ten slotte, aangezien veel koralen symbiotisch zijn, is het gebruik van respirometrie om fotosynthese naast ademhaling te karakteriseren bijzonder nuttig voor het contextualiseren van P:R-verhoudingen en om te begrijpen of de symbiose stabiel is of niet (bijv. referentie23).
Veranderingen in het milieu veroorzaken daarom verschuivingen in de energiebudgetten van het koraal en zijn symbionten, wat leidt tot verschillen in groei14. Om het hoofd te bieden, kan de koraalgastheer de ademhaling en het gebruik van lipiden verhogen om aan de metabolische eisen te voldoen; Hittestress kan de netto productiviteit met 60% verminderen als gevolg van deze verhoogde ademhaling14, gemeten aan de hand van een verandering in opgeloste zuurstof. Symbiodiniaceae kunnen ook de stikstofassimilatie en koolstofretentie verhogen14,24, en deze reserves vervolgens gebruiken om energie te verschuiven naar hun eigen reparatie- en beschermingsmechanismen25,26. De balans van N en C is belangrijk voor het reguleren van de groei, en P in het bijzonder27, die zich kan manifesteren als een dynamische regulatie van symbionten. Inderdaad, bewijs verzameld van koralen over grote rifvlakten (>1.000 km) suggereert dat gastheren het vermogen hebben om symbiontengroei te beperken door de regulatie van P, hoewel dit per koraalsoort verschilt.
Alles bij elkaar genomen suggereren deze studies een winst van hittetolerantie met een gelijktijdige afname van de productie of translocatie van voedingsstoffen (d.w.z. de neiging tot symbiose) als gevolg van veranderingen in het milieu. Krachtige enkelvoudige juveniele methoden, zoals het kwantificeren van zuurstofgebruik via micro-respirometrie, moeten daarom worden gebruikt om de fundamentele mechanismen met betrekking tot het metabolisme te begrijpen en vervolgens worden toegepast op instandhoudingskwesties zoals het begrijpen van warmtetolerantieverwerving. Dit wordt hier gepresenteerd als een micro-respirometrie-instrument voor fysiologische metingen, bedoeld om de voedingsrelatie tussen koraaljuvenielen en hun algensymbionten te onderzoeken, maar geschikt voor andere kleine mariene organismen.
Het gebruik of de productie van zuurstof door organismen kan worden gemeten door ze in afzonderlijke, hermetisch afgesloten respirometriekamers of ‘respirometers’ (hierna “kamers” genoemd) te plaatsen, waar de zuurstofverandering wordt gemeten met behulp van optodes3. Optodes zijn sondes die de zuurstofconcentratie meten met behulp van lichtpulsen, en het loggen van metingen in de loop van de tijd maakt het mogelijk om ademhalings- en/of fotosynthesesnelheden te berekenen. In de praktijk is het meten van de ademhaling vergelijkbaar met het meten van fotosynthese in koralen, behalve dat de koralen in totale duisternis worden geïncubeerd. Het aftrekken van de totale dagelijkse ademhaling van het koraal en de symbionten van de totale dagelijkse fotosynthese resulteert in een zuurstofverschil (zuurstofdelta)2,3. Over het algemeen gebruiken organismen meer zuurstof dan ze produceren, wat resulteert in een tekort. Dit kan worden omgerekend naar koolstofequivalenten, aangezien zuurstof en koolstof in een vaste verhouding2 worden verbruikt. Het koolstofoverschot kan door het koraal worden gebruikt voor groei, slijmsynthese en -voortplanting, en andere essentiële metabolischebehoeften12.
Dit protocol beschrijft een micro-respiratiemethode (Figuur 1) die werd gebruikt voor het meten van de ademhalingssnelheid (R) voor individuele koraaljuvenielen met behulp van een op maat gemaakt 1,5 ml glazen kamerontwerp (flacon met GL25-schroefdraad en 20 mm hoog, met bult/nok, platgeslepen rand en schroefdop met gat; zie Tabel met materialen) gevuld met 0,5 μm gefilterd zeewater. Glasvezeloptoden (zie Materiaaltabel) werden in elke kamer ingebracht via een gat in de zijkant van het deksel. Elk individueel koraal werd bevestigd boven een hard gaas, doorstroomroerplaatplatform boven een magnetische roerstaaf om een adequate menging van water in de kamer te garanderen. In het representatieve voorbeeld hier werden twee controles of “blanco’s” (kamers die identiek waren, behalve de aanwezigheid van het monster) gelijktijdig gemeten met de drie gerepliceerde monsterkamers, omdat we meerdere controllers tegelijkertijd hadden draaien. Het installatievoorbeeld (Figuur 2) toont echter alleen het gebruik van vier kanalen; Dit kan worden verhoogd met behulp van meerdere controllers en meerdere doorstroomstandaards. De temperatuur kan in dit systeem ook worden geregeld door elke kamer onder te dompelen in een op maat gemaakt waterbad met vooraf ingestelde watertemperaturen (27 °C voor controle of 31 °C voor de hoge temperatuurbelasting in de voorbeeldgegevens hier) met behulp van een recirculerend doorstroomsysteem (continue, zachte stroom ingesteld op 75 l/h). Het roerplaatplatform en de roerplaat met tandwielen kunnen elke grootte hebben en kunnen zo groot of zo klein worden gemaakt als nodig is om het aantal glazen kamers te huisvesten. In dit voorbeeld waren het platform en de plaat ongeveer 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabel met materialen). Kalibratie van de optodes werd vóór elke run uitgevoerd met behulp van twee standaardoplossingen die 0% en 100% zuurstofverzadiging vertegenwoordigen bij de juiste watertemperatuur en zoutgehalte voor deze experimentele setting.
Dit werk schetst de constructie van een op maat gemaakte micro-respirometrie-opstelling die kan worden gebruikt om de hoeveelheid zuurstof te kwantificeren die wordt verbruikt en geproduceerd door kleine sessiele waterorganismen. De kritische componenten van dit protocol omvatten de opstelling van de kamers, inclusief de spots, en de kalibratie van het lage signaal met behulp van het respR-pakket , waarin een laag signaal kan worden gedefinieerd als snelheden die worden gekenmerkt door ondiepe of luidruchtige hellingen. De aangepaste kamer en de opstelling ervan maken het mogelijk om zelfs lage signalen te detecteren, terwijl het gebruik van het R-pakket helpt beschermen tegen problemen waarbij het optreden van ondiepe of luidruchtige hellingen kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de resultaten (bijv. vals-positieven).
Mogelijke aanpassingen die nodig zijn voor andere gebruikers zijn onder meer het vastzetten van het organisme van belang in de op maat gemaakte kamer. In dit geval werden een kleine, stijve ritssluiting en aquariumlijm gebruikt om het enkele juveniel aan de plastic basis te bevestigen, die vervolgens op de stropdas werd gelijmd. Opgemerkt moet worden dat voor dit experiment koraaljuvenielen werden neergezet op zwarte plastic zeilen. Dit plastic zorgde voor een gemakkelijke verwijdering van de koraaljuvenielen, die effectief van het plastic gleden, om ze tijdens het verwijderen niet fysiek te beschadigen. Jonge koraalplanten hechten zich aan het substraat waarop ze zich nestelen, dus het wordt aanbevolen om ze op vergelijkbaar plastic materiaal te laten rusten, met behulp van een kunstmatig peptide16 om hun verwijdering voor het lijmproces te vergemakkelijken. Om de hanteringsstress en de impact op de ademhalingsrespons verder te minimaliseren, wordt aanbevolen om de koralen die aan kabelbinders zijn gemonteerd 1-2 weken te laten acclimatiseren, zoals gebruikelijk is bij veel volwassen koraalstressexperimenten. Andere aanpassingen kunnen nodig zijn om het organisme boven de plek in het deksel te bevestigen en om watercirculatie mogelijk te maken. Een andere belangrijke stap voor het oplossen van problemen is signaaldetectie, met name op de helling van de zuurstoftijdreeks waar de snelheden moeten worden bepaald. Uiteindelijk komt dit neer op een combinatie van het gebruik van gezond verstand om duidelijk instabiele gegevens uit te sluiten, en de functies binnen respR om snelheden te extraheren uit consistent gekozen regio’s of automatisch door lineaire regio’s van de gegevens te identificeren. Verdere voorbeelden van hoe u dit kunt doen, zijn beschikbaar op de website van respR .
Deze methode is ontwikkeld om metingen van de ondergrens van de ademhaling uit te breiden tot extreem kleine, sessiele ongewervelde zeedieren. De voor de hand liggende beperking is dat dit protocol vatbaarder kan zijn voor vals-positieven in vergelijking met protocollen die zijn ontworpen voor grotere biomassa’s. Aangezien dit echter het punt van het ontwerp was – om deze ondergrenzen te meten – is dit in het ontwerp meegenomen en kan de procedure worden gebruikt met het respR-pakket om beter te beschermen tegen vals-positieven. Het is ook belangrijk om te erkennen dat er andere systemen bestaan voor het meten van ademhaling30 en het meten van kleine organismen, waaronder respirometrie op individuele roeipootkreeftjes31 in kleinere volumes dan dit (~0,5-1 ml), maar die ofwel duur zijn of specifieke componenten missen (roervermogen). Dit systeem is echter open-source en relatief goedkoop in vergelijking met commerciële systemen (bijv. Core Microplate-systeem). Dit systeem omvat ook belangrijke methodologische overwegingen, zoals roeren, die andere systemen mogelijk niet hebben. De interne roerstaaffunctie is essentieel om de natuurlijke watermenging van veel mariene organismen (bijv. roeipootkreeftjes via zwemmen) na te bootsen, wat vaak niet mogelijk is en de gegevens grotendeels onbruikbaar kan maken. Andere beschikbare mengmethoden daarentegen zijn het plaatsen van de hele ademhalingsmeter op een gigantische tuimelbank, waarvoor extra apparatuur nodig is en beperkt succes is bij het mengen, of mengen via trillingen, wat verstoring van het organisme kan veroorzaken. Om deze reden is dit het enige systeem dat respirometrie kan uitvoeren op juveniele koralen of andere zeer kleine sessiele organismen. Ter referentie: het groottebereik van de hier opgenomen exemplaren varieerde van 2,1 tot 3,6 poliepen (overeenkomend met slechts een paar maanden oud), met een minimale tot maximale gemiddelde oppervlakte van 1,3 tot 4,5mm2.
Respirometrie is een fundamentele maatstaf in ecologische studies en er bestaan veel methoden voor dit doel. De meeste van deze bestaande methoden zijn echter gericht op monsters met een hoge biomassa, waaronder hele vissen, koraalfragmenten of zeegrassen 32,33,34. Deze methode is de eerste die gebruik maakt van individuele koraaljuvenielen. Bovendien zijn er veel potentiële toepassingen voor deze methode, omdat het belangrijke fysiologische informatie geeft over het functioneren van het organisme. Dit kan belangrijk zijn voor studies die de basisschattingen van de gezondheid willen karakteriseren35, inzicht willen krijgen in de rol van acute of langdurige stress tijdens koraalontogenie zoals hittestress36, of om drempels te bieden die managers kunnen instellen om de gezondheid van koraalriffen te helpen beschermen en verbeteren37. Gezien het feit dat het koraal een holobiont is en de symbiontengemeenschap in dit stadium en gedurende heteerste levensjaar relatief flexibel is, zou het interessant zijn om respirometriegegevens te koppelen aan veranderingen in gemeenschappen in de loop van de tijd, om het functioneren van het organisme als geheel volledig te contextualiseren. Belangrijk is dat deze methode bijdraagt aan ‘open science’-technieken die helpen om een schets te geven voor het creëren van aangepaste experimentele opstellingen die openlijk kunnen worden gedeeld, verbeterd en gestandaardiseerd.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Sam Noonan bedanken voor zijn hulp en advies, Sven Uthicke voor het gebruik van de initiële respirometriekamers, Ben Shelab voor zijn technische illustratie en de workshop van het Australian Institute of Marine Science voor op maat gemaakte bewerking van respirometriekameradapters en -houders. De koralen werden verzameld onder de volgende vergunning van het Great Barrier Reef Marine Park voor AIMS G12/ 35236.1. Koralen hebben geen ethische vergunningen nodig.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |