Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines Mikro-Respirometrie-Systems, mit dem die physiologischen Merkmale des Korallenholobionten untersucht werden können.
Die Stoffwechselaktivität, definiert als die Summe der organismischen Prozesse, die Energie beinhalten, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Funktion und Evolution des Lebens auf der Erde. Die Messung der Stoffwechselraten von Organismen steht daher im Mittelpunkt der Erklärung des physiologischen Zustands von Organismen, ihrer ökologischen Rolle und der Auswirkungen von Umweltveränderungen auf Arten in terrestrischen und aquatischen Ökosystemen. An Korallenriffen wurden Messungen des Stoffwechsels verwendet, um die Symbiosefunktion zwischen Korallen und ihren obligaten Algensymbionten (Symbiodiniaceae) zu quantifizieren und zu bewerten, wie sich Umweltstressoren, einschließlich des Klimawandels, auf die Gesundheit der Korallen auswirken. Trotz dieser Bedeutung fehlen Methoden und damit Daten zur Messung der Stoffwechselrate bei Korallennachkommen, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Größe. Um diese Lücke zu schließen, zielte diese Studie darauf ab, einen maßgeschneiderten Aufbau zur Messung der Atmung kleiner (Millimeterbereich) Meerestierökologien zu entwickeln. Diese geringen Kosten und die einfache Einrichtung sollten eine verbesserte Messung der Stoffwechselrate ermöglichen. Dies wird für die angewandte ökologische Forschung, die die sexuelle Produktion von Korallen zur Wiederherstellung von Riffen nutzt, von entscheidender Bedeutung sein.
Die Atmung ist eine kritische biologische Messung, die die gesamte Stoffwechselaktivität eines Organismus signalisiert, aber wie andere kritische Merkmale (Wachstum) bei kleinen Organismen schwer zu messenist 1. Atmung kann als Oxidation organischer Moleküle durch die Verwendung von Sauerstoff definiert werden. Dieser Prozess erzeugt die chemische Energie, die für die Zellfunktion (d. h. den Stoffwechsel) benötigt wird, die für das Überleben von Organismen unerlässlich ist. Alternativ führt der anaerobe Stoffwechsel zu einer Sauerstoffschuld2. Die Atemfrequenz kann mit Hilfe von Optoden bestimmt werden, die den Verbrauch (und damit die Abnahme) der Sauerstoffkonzentration im Laufe der Zeit in einer geschlossenen Kammer messen, eine Praxis, die allgemein als Respirometriebekannt ist 3. Da die meisten Organismen keinen Sauerstoff speichern, kann die Stoffwechselrate durch die direkte Korrelation zwischen Atmung und Kohlenstoffverbrauch abgeleitet werden. Aus diesem Grund können die Atemfrequenzen in den täglichen Kohlenstoffverbrauch umgewandelt werden, was wichtige Stoffwechselfunktionen wie Wachstum, Fortpflanzung und die Fähigkeit, die metabolische Homöostase in Zeiten von Umweltstress aufrechtzuerhalten, informiert 4,5, einschließlich Hitzewellenbedingungen, die im Allgemeinen zu Stress oder Bleiche bei Korallen führen.
Die Korallenriffe gehen weltweit immer schneller zurück. Das Korallentier beherbergt ein Konsortium von Partnern (darunter Dinoflagellaten-Symbiodiniaceae, Pilze, Bakterien und Viren), die zusammen als “Holobiont” bezeichnet werden6. Mit steigenden Meerestemperaturen stehen Korallen und damit Korallenriffe unter zunehmendem Überlebensdruck, da hohe Temperaturen zum Verlust der Dinoflagellaten-Symbiodiniaceae (im Folgenden Symbionten) führen, ein Phänomen, das als Bleiche bekannt ist7. Viele Nährstoffe sind für Korallen in oligotrophen tropischen Gewässern sonst nicht verfügbar, darunter anorganischer Stickstoff und Phosphor8. Um damit fertig zu werden, bilden Korallen eine obligate Nahrungssymbiose mit ihren Dinoflagellaten-Symbionten (Symbiodiniaceae), die den Großteil der Nährstoffe liefern, die der Korallenwirt zum Überleben benötigt und seine Kalziumkarbonat-Skelette ablagert9. Eine funktionierende Symbiose kann durch ein hohes Maß an Kohlenstoffteilung zwischen den Partnern gekennzeichnet sein10,11, und die Regulation der Symbiose beinhaltet eine dynamische Homöostase12.
Bei Hitzestress werden diese dynamische Regulation und Kommunikation gestört, was zu Dysbiose und Bleichen führt (siehe Referenz13). Stoffwechselmessungen wie Photosynthese und Atmung haben daher das Potenzial, sowohl den gesunden als auch den unregulierten, dysbiotischen Zustand von Korallen aufzuklären, und die genaue Messung dieser Prozesse über die Ontogenese hinweg ist entscheidend für das Verständnis der Funktionsweise von Organismen. Dies ist besonders wichtig, da die Häufigkeit und das Ausmaß von Massenbleichen zunehmen und das Potenzial haben, Veränderungen in der Nährstoffverteilung der Symbionten zu beeinflussen, bei denen der Kohlenstofftransfer mit steigenden Temperaturen abnimmt14. Dies könnte auf gesteuerte Mechanismen des Symbionten zurückzuführen sein, die Nährstoffe binden, oder auf harte physiologische Kompromisse (erhöhte thermische Toleranz, aber eine Verringerung des Überlebens des Wirts 15,16,17). Störungen in der Symbiose können sowohl vom Symbionten als auch vom Wirt herrühren, obwohl ein führender Faktor wahrscheinlich die zelluläre Fehlfunktion des Symbiontenist 18. Stress durch steigende Meerwassertemperaturen destabilisiert diese Symbiose jedoch; Die Kohlenstoffteilung vom Symbionten zum Wirt ist verringert19,20, und es kann zu einem Hungertod der Korallen kommen. Dies kann sich in verminderten Lipid- und Kohlenhydratspeichern in Korallen aufgrund einer erhöhten Wirtsnutzung (“erhöhter Katabolismus von fixiertem Kohlenstoff”) widerspiegeln, wahrscheinlich aufgrund einer verminderten gemeinsamen Nutzung durch Symbionten11. Neben dem Beitrag der Photosynthese und der Atmung der Symbionten der Korallen ist die Atmung des Korallentieres ein wichtiges Maß, um die Gesundheit der Korallen, die Auswirkungen der Bleiche und des Nährstoffaustauschs zwischen diesen Partnern und das Wachstum des Holobionten zu verstehen, ein Phänotyp, der für das Überleben von Umweltveränderungen relevant ist 8,21,22. Da viele Korallen symbiotisch sind, ist die Verwendung der Respirometrie zur Charakterisierung der Photosynthese zusätzlich zur Atmung besonders nützlich, um das P:R-Verhältnis zu kontextualisieren und zu verstehen, ob die Symbiose stabil ist oder nicht (z. B. Referenz23).
Umweltveränderungen führen daher zu Verschiebungen im Energiehaushalt der Koralle und ihrer Symbionten, was zu Unterschieden im Wachstum führt14. Um damit fertig zu werden, kann der Korallenwirt die Atmung und den Lipidverbrauch erhöhen, um seinen Stoffwechselbedarf zu decken; Hitzestress kann die Nettoproduktivität aufgrund dieser erhöhten Atmung um 60 % verringern14, gemessen an einer Änderung des gelösten Sauerstoffs. Symbiodiniaceae können auch die Stickstoffassimilation und Kohlenstoffretention erhöhen14,24 und diese Reserven dann nutzen, um Energie auf ihre eigenen Reparatur- und Schutzmechanismen zu verlagern25,26. Das Gleichgewicht von N und C ist wichtig für die Regulierung des Wachstums und insbesondere von P27, was sich als dynamische Regulation der Symbiontenhäufigkeit manifestieren kann. Tatsächlich deuten Beweise, die von Korallen in großen Riffgebieten (>1.000 km) gesammelt wurden, darauf hin, dass Wirte die Fähigkeit haben, das Wachstum von Symbionten durch die Regulierung von P zu begrenzen, obwohl dies je nach Korallenart variiert27.
Zusammengenommen deuten diese Studien auf einen Gewinn an Hitzetoleranz mit einer gleichzeitigen Abnahme der Produktion oder Translokation von Nährstoffen (d.h. der Neigung zur Symbiose) aufgrund von Umweltveränderungen hin. Leistungsstarke Methoden für Einzeljuvenile, wie z. B. die Quantifizierung des Sauerstoffverbrauchs durch Mikrorespirometrie, sollten daher verwendet werden, um die grundlegenden Mechanismen in Bezug auf den Stoffwechsel zu verstehen, und dann auf Konservierungsfragen wie das Verständnis des Erwerbs von Hitzetoleranz angewendet werden. Dies wird hier als Mikro-Respirometrie-Werkzeug für physiologische Messungen vorgestellt, das die Ernährungsbeziehung zwischen Korallenjungtieren und ihren Algensymbionten abfragen soll, aber auch für andere kleine Meeresorganismen geeignet ist.
Die Verwendung oder Produktion von Sauerstoff durch Organismen kann gemessen werden, indem sie in einzelne, hermetisch abgeschlossene Respirometriekammern oder “Respirometer” (nachstehend “Respirometer” (nachstehend “Respirometer” genannt) gelegt werden, in denen die Sauerstoffveränderung mit Hilfe von Optodengemessen wird 3. Optoden sind Sonden, die die Sauerstoffkonzentration mithilfe von Lichtimpulsen messen, und die Protokollierung von Messungen im Laufe der Zeit ermöglicht die Berechnung von Atmungs- und/oder Photosyntheseraten. In der Praxis ähnelt die Messung der Atmung der Messung der Photosynthese in Korallen, nur dass die Korallen in völliger Dunkelheit inkubiert werden. Subtrahiert man die gesamte tägliche Atmung der Korallen und Symbionten von der gesamten täglichen Photosynthese, so ergibt sich ein Sauerstoffunterschied (Sauerstoffdelta)2,3. Im Allgemeinen verbrauchen Organismen mehr Sauerstoff als sie produzieren, was zu einem Defizit führt. Dies kann in Kohlenstoffäquivalente umgerechnet werden, da Sauerstoff und Kohlenstoff in einem festen Verhältnisverbraucht werden 2. Der Kohlenstoffüberschuss kann von der Koralle für das Wachstum, die Schleimsynthese und -vermehrung sowie andere wichtige Stoffwechselbedürfnisse verwendet werden12.
Dieses Protokoll beschreibt eine Mikrorespirationsmethode (Abbildung 1), die zur Messung der Atmungsraten (R) für einzelne Korallenjungtiere unter Verwendung eines maßgeschneiderten 1,5-ml-Glaskammerdesigns (Fläschchen mit GL25-Gewinde und 20 mm Höhe, mit Stoßkante/Grat, flachem Bodenrand und Schraubverschluss mit Loch; siehe Materialtabelle) verwendet wurde, das mit 0,5 μm gefiltertem Meerwasser gefüllt war. Faseroptische Optoden (siehe Materialtabelle) wurden durch ein Loch in der Seite des Deckels in jede Kammer eingeführt. Jede einzelne Koralle wurde über einer durchströmbaren Rührplattenplattform mit hartem Netz über einem magnetischen Rührstab befestigt, um eine ausreichende Durchmischung des Wassers in der Kammer zu gewährleisten. Im repräsentativen Beispiel hier wurden zwei Kontrollen oder “Leerzeichen” (Kammern, die bis auf das Vorhandensein der Probe identisch waren) gleichzeitig mit den drei Kammern der Replikatprobe gemessen, da mehrere Controller gleichzeitig liefen. Das Setup-Beispiel (Abbildung 2) zeigt jedoch nur die Verwendung von vier Kanälen. Dies kann durch mehrere Controller und mehrere Durchflussständer erhöht werden. Die Temperatur konnte in diesem System auch geregelt werden, indem jede Kammer in ein maßgeschneidertes Wasserbad mit voreingestellten Wassertemperaturen (27 °C für die Steuerung oder 31 °C für die hohe Temperaturbelastung in den Beispieldaten hier) mit einem Umlaufdurchströmungssystem (kontinuierlicher, sanfter Durchfluss mit 75 l/h) getaucht wurde. Die Rührplattenplattform und die Rührplatte mit Zahnrädern können beliebig groß sein und so groß oder so klein wie nötig gefertigt werden, um die Anzahl der Glaskammern aufzunehmen. In diesem Beispiel waren die Plattform und die Platte etwa 34 cm x 26 cm x 3 cm groß (Materialtabelle). Die Kalibrierung der Optoden wurde vor jedem Lauf mit zwei Standardlösungen durchgeführt, die eine Sauerstoffsättigung von 0 % und 100 % bei der entsprechenden Wassertemperatur und dem entsprechenden Salzgehalt für diese Versuchsanordnung darstellen.
Diese Arbeit skizziert den Aufbau eines maßgeschneiderten Mikro-Respirometrie-Setups, mit dem die Menge an Sauerstoff quantifiziert werden kann, die von kleinen sessilen Wasserorganismen verbraucht und produziert wird. Zu den kritischen Komponenten dieses Protokolls gehören der Aufbau der Kammern, einschließlich der Spots, und die Kalibrierung des Low-Signals mit dem respR-Paket , in dem ein Low-Signal als Raten definiert werden kann, die durch flache oder verrauschte Flanken gekennzeichnet sind. Die benutzerdefinierte Kammer und ihr Aufbau ermöglichen die Erkennung auch niedriger Signale, während die Verwendung des R-Pakets zum Schutz vor Problemen beiträgt, bei denen das Auftreten von flachen oder verrauschten Steigungen zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse führen könnte (z. B. falsch positive Ergebnisse).
Zu den möglichen Modifikationen, die für andere Benutzer erforderlich sind, gehört die Sicherung des interessierenden Organismus in der maßgefertigten Kammer. In diesem Fall wurden ein kleiner, starrer Kabelbinder und Aquarienkleber verwendet, um das einzelne Jungtier an der Kunststoffbasis zu befestigen, die dann auf die Krawatte geklebt wurde. Es ist zu beachten, dass für dieses Experiment Korallenjungtiere auf schwarzen Plastikfolien angesiedelt wurden. Dieser Kunststoff ermöglichte die einfache Entfernung der Korallenjungtiere, die effektiv vom Kunststoff abrutschten, um sie während der Entfernung nicht physisch zu verletzen. Korallenjungtiere haften an dem Substrat, auf dem sie sich ansiedeln, daher wird empfohlen, sie auf ähnlichem Kunststoffmaterial unter Verwendung eines künstlichen Peptids16 anzusiedeln, um ihre Entfernung für den Klebeprozess zu erleichtern. Um den Handhabungsstress und die Auswirkungen auf die Atmungsreaktion weiter zu minimieren, wird empfohlen, die an Kabelbindern montierten Korallen 1-2 Wochen lang akklimatisieren zu lassen, wie es bei vielen Stressexperimenten mit erwachsenen Korallen üblich ist. Möglicherweise sind weitere Modifikationen erforderlich, um den Organismus über der Stelle im Deckel zu sichern und die Wasserzirkulation zu ermöglichen. Ein weiterer wichtiger Schritt zur Fehlerbehebung ist die Signalerkennung, insbesondere an der Steigung der Sauerstoffzeitreihe, in der die Raten bestimmt werden sollten. Letztendlich läuft dies auf eine Kombination aus gutem Urteilsvermögen hinaus, um offensichtlich instabile Daten auszuschließen, und den Funktionen innerhalb von respR , die es ermöglichen, Raten entweder aus konsistent ausgewählten Regionen oder automatisch durch Identifizierung linearer Regionen der Daten zu extrahieren. Weitere Beispiele dafür finden Sie auf der Website von respR .
Diese Methode wurde entwickelt, um Messungen der unteren Atmungsgrenze auf extrem kleine, sessile wirbellose Meerestiere auszudehnen. Die offensichtliche Einschränkung besteht darin, dass dieses Protokoll im Vergleich zu Protokollen, die für größere Biomassen entwickelt wurden, anfälliger für falsch positive Ergebnisse sein kann. Da dies jedoch der Sinn des Designs war – diese unteren Grenzwerte zu messen – wurde dies in das Design einbezogen, und das Verfahren kann mit dem respR-Paket verwendet werden, um sich besser vor Fehlalarmen zu schützen. Es ist auch wichtig anzuerkennen, dass es andere Systeme zur Messung der Atmung30 und zur Messung kleiner Organismen, einschließlich der Respirometrie an einzelnen Copepoden31 in kleineren Volumina (~0,5-1 ml), gibt, die jedoch entweder teuer sind oder spezifische Komponenten (Rührfähigkeit) fehlen. Dieses System ist jedoch Open Source und im Vergleich zu kommerziellen Systemen (z. B. Core Microplate System) relativ kostengünstig. Dieses System beinhaltet auch wichtige methodische Überlegungen wie das Rühren, die anderen Systemen möglicherweise fehlen. Die interne Rührstabfunktion ist unerlässlich, um die natürliche Wassermischung vieler Meeresorganismen (z. B. Copepoden durch Schwimmen) zu replizieren, was oft nicht möglich ist und die Daten weitgehend unbrauchbar machen kann. Im Gegensatz dazu besteht bei anderen verfügbaren Mischmethoden das Platzieren des gesamten Respirometers auf einer riesigen Wippbank, die zusätzliche Ausrüstung erfordert und nur begrenzten Erfolg beim Mischen hat, oder das Mischen durch Vibration, die den Organismus stören kann. Aus diesem Grund ist dies das einzige System, das eine Respirometrie an jungen Korallen oder anderen sehr kleinen sitzenden Organismen durchführen kann. Als Referenz reichte der Größenbereich der hier enthaltenen Exemplare von 2,1 bis 3,6 Polypen (entspricht nur wenigen Monaten) mit einer minimalen bis maximalen mittleren Fläche von 1,3 bis 4,5 mm2.
Die Respirometrie ist ein grundlegendes Maß in ökologischen Studien, und es gibt viele Methoden für diesen Zweck. Die meisten dieser bestehenden Methoden zielen jedoch auf Proben mit hoher Biomasse ab, darunter ganze Fische, Korallenfragmente oder Seegräser 32,33,34. Diese Methode ist die erste, bei der einzelne Korallenjungtiere verwendet werden. Darüber hinaus gibt es viele Anwendungsmöglichkeiten für diese Methode, da sie wichtige physiologische Informationen über die Funktionsweise des Organismus liefert. Dies kann für Studien wichtig sein, die darauf abzielen, grundlegende Gesundheitsschätzungen zu charakterisieren35, die Rolle von akutem oder langfristigem Stress während der Korallenontogenese wie Hitzestresszu verstehen 36 oder Schwellenwerte bereitzustellen, die Manager festlegen können, um die Gesundheit von Korallenriffen zu schützen und zu verbessern37. Angesichts der Tatsache, dass die Koralle ein Holobiont ist und die Symbiontengemeinschaft in diesem Stadium und während des ersten Lebensjahres relativ flexibel ist38, wäre es interessant, Respirometriedaten mit Veränderungen in den Gemeinschaften im Laufe der Zeit zu koppeln, um die Funktionsweise des Organismus als Ganzes vollständig zu kontextualisieren. Wichtig ist, dass diese Methode zu “Open Science”-Techniken beiträgt, die dazu beitragen, einen Überblick über die Erstellung benutzerdefinierter Versuchsaufbauten zu geben, die offen geteilt, verbessert und standardisiert werden können.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken Sam Noonan für seine Hilfe und seinen Rat, Sven Uthicke für die Verwendung der ersten Respirometriekammern, Ben Shelab für seine technische Illustration und dem Workshop des Australian Institute of Marine Science für die maßgeschneiderte Bearbeitung von Respirometriekammeradaptern und -haltern. Die Korallen wurden im Rahmen der folgenden Genehmigung des Great Barrier Reef Marine Park gemäß AIMS G12/ 35236.1 gesammelt. Korallen benötigen keine Ethikgenehmigungen.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |