Ce protocole décrit la mise en place et le fonctionnement d’un système de micro-respirométrie qui peut être utilisé pour étudier les caractéristiques physiologiques de l’holobionte corallien.
L’activité métabolique, définie comme la somme des processus de l’organisme qui impliquent de l’énergie, est d’une importance cruciale pour comprendre la fonction et l’évolution de la vie sur terre. La mesure des taux métaboliques des organismes est donc au centre de l’explication des états physiologiques des organismes, de leurs rôles écologiques et de l’impact des changements environnementaux sur les espèces au sein des écosystèmes terrestres et aquatiques. Sur les récifs coralliens, des mesures du métabolisme ont été utilisées pour quantifier le fonctionnement de la symbiose entre les coraux et leurs symbiotes d’algues obligatoires (Symbiodiniaceae), ainsi que pour évaluer l’impact des facteurs de stress environnementaux, y compris le changement climatique, sur la santé des coraux. Malgré cette importance, il y a un manque de méthodes, et donc de données, relatives aux mesures du taux métabolique chez la progéniture corallienne, probablement en raison de leur petite taille. Pour combler cette lacune, cette étude visait à développer une configuration personnalisée pour mesurer la respiration des écologies des animaux marins de petite taille (gamme de tailles millimétriques). Cette configuration facile et peu coûteuse devrait permettre d’améliorer la mesure du taux métabolique. Cela sera essentiel pour la recherche écologique appliquée utilisant la production sexuée de coraux pour la restauration des récifs.
La respiration est une mesure biologique critique qui signale l’activité métabolique globale d’un organisme, mais comme d’autres traits critiques (croissance), elle est difficile à mesurer chez les petits organismes1. La respiration peut être définie comme l’oxydation de molécules organiques par l’utilisation d’oxygène. Ce processus génère l’énergie chimique nécessaire à la fonction cellulaire (c’est-à-dire au métabolisme), qui est essentielle à la survie des organismes. Alternativement, le métabolisme anaérobie entraîne une dette d’oxygène2. Les taux de respiration peuvent être déterminés à l’aide d’optodes qui mesurent l’utilisation (et donc la diminution) de la concentration d’oxygène au fil du temps dans une chambre fermée, une pratique généralement connue sous le nom de respirométrie3. Étant donné que la majorité des organismes ne stockent pas d’oxygène, le taux de métabolisme peut être déduit de la corrélation directe entre la respiration et l’utilisation du carbone. Pour cette raison, les taux de respiration peuvent être convertis en consommation quotidienne de carbone, qui informe les fonctions métaboliques essentielles telles que la croissance, la reproduction et la capacité à maintenir l’homéostasie métabolique pendant les périodes de stress environnemental 4,5, y compris les conditions de canicule qui entraînent généralement un stress ou un blanchissement chez les coraux.
Les récifs coralliens déclinent à un rythme accéléré dans le monde. L’animal corallien abrite un consortium de partenaires (comprenant des dinoflagellés Symbiodiniaceae, des champignons, des bactéries et des virus), collectivement appelés « holobionte »6. À mesure que les températures des océans augmentent, les coraux, et donc les récifs coralliens, subissent une pression croissante pour survivre, car les températures élevées entraînent la perte des dinoflagellés Symbiodiniaceae (ci-après symbiotes), un phénomène connu sous le nom de blanchissement7. De nombreux nutriments ne sont pas disponibles pour les coraux dans les eaux tropicales oligotrophes, notamment l’azote inorganique et le phosphore8. Pour y faire face, les coraux forment une symbiose nutritionnelle obligatoire avec leurs symbiotes dinoflagellés (Symbiodiniaceae), qui fournissent la majorité des nutriments nécessaires à l’hôte corallien pour survivre et déposer leurs squelettes de carbonate de calcium9. Une symbiose fonctionnelle peut être caractérisée par des niveaux élevés de partage du carbone entre les partenaires10,11, et la régulation de la symbiose implique une homéostasie dynamique12.
Pendant le stress thermique, cette régulation dynamique et cette communication sont perturbées, ce qui entraîne une dysbiose et un blanchissement (examiné dans la référence13). Les mesures métaboliques, telles que la photosynthèse et la respiration, ont donc le potentiel d’élucider à la fois les états dysbiotiques sains et non régulés des coraux, et la mesure précise de ces processus à travers l’ontogenèse est essentielle pour comprendre le fonctionnement des organismes. Ceci est particulièrement important car la fréquence et l’ampleur des événements de blanchissement de masse augmentent, avec le potentiel d’influencer les changements dans le partage des nutriments des symbiotes, où le transfert de carbone diminue à mesure que les températures augmentent14. Cela pourrait être dû à des mécanismes dirigés par le symbiote séquestrant les nutriments ou à des compromis physiologiques difficiles (tolérance thermique accrue mais diminution de la survie de l’hôte 15,16,17). Les perturbations de la symbiose peuvent provenir à la fois du symbiote et de l’hôte, bien qu’un facteur majeur soit probablement le dysfonctionnement cellulaire du symbiote18. Cependant, le stress causé par l’augmentation de la température de l’eau de mer déstabilise cette symbiose ; Le partage du carbone entre le symbiote et l’hôte est diminué19,20, et la famine du corail peut s’ensuivre. Cela peut se traduire par une diminution des réserves de lipides et de glucides dans les coraux en raison de l’utilisation accrue de l’hôte (« catabolisme accru du carbone fixe »), probablement en raison d’une diminution du partage par les symbiotes11. Parallèlement à la contribution de la photosynthèse et de la respiration des symbiotes des coraux, la respiration de l’animal corallien est une mesure importante pour comprendre la santé des coraux, les impacts du blanchissement et de l’échange de nutriments entre ces partenaires, et la croissance de l’holobionte, un phénotype pertinent pour survivre aux changements environnementaux 8,21,22. Enfin, étant donné que de nombreux coraux sont symbiotiques, l’utilisation de la respirométrie pour caractériser la photosynthèse en plus de la respiration est particulièrement utile pour contextualiser les rapports P :R et comprendre si la symbiose est stable ou non (e.g., référence23).
Les changements environnementaux provoquent donc des changements dans les bilans énergétiques du corail et de ses symbiotes, entraînant des différences de croissance14. Pour y faire face, l’hôte corallien peut augmenter sa respiration et son utilisation des lipides pour répondre à ses besoins métaboliques ; Le stress thermique peut réduire la productivité nette de 60 % en raison de cette respiration accrue14, mesurée par une modification de l’oxygène dissous. Les symbiodiniacées peuvent également augmenter l’assimilation de l’azote et la rétention du carbone14,24, puis utiliser ces réserves pour déplacer l’énergie vers leurs propres mécanismes de réparation et de protection25,26. L’équilibre de N et C est important pour réguler la croissance, et P en particulier27, qui peut se manifester par une régulation dynamique de l’abondance des symbiotes. En effet, les preuves recueillies sur les coraux de grandes étendues récifales (>1 000 km) suggèrent que les hôtes ont la capacité de limiter la croissance des symbiotes par la régulation du P, bien que cela varie selon les espèces de coraux27.
Prises ensemble, ces études suggèrent un gain de tolérance à la chaleur avec une diminution concomitante de la production ou de la translocation des nutriments (c’est-à-dire la propension à la symbiose) en raison des changements environnementaux. Des méthodes puissantes sur un seul juvénile, telles que la quantification de l’utilisation de l’oxygène par micro-respirométrie, devraient donc être utilisées pour comprendre les mécanismes fondamentaux liés au métabolisme, puis appliquées à des questions de conservation telles que la compréhension de l’acquisition de la tolérance à la chaleur. Il est présenté ici comme un outil de micro-respirométrie pour les mesures physiologiques, destiné à interroger la relation nutritionnelle entre les juvéniles coralliens et leurs symbiotes algals, mais adapté à d’autres petits organismes marins.
L’utilisation ou la production d’oxygène par les organismes peut être mesurée en les plaçant dans des chambres de respirométrie individuelles hermétiquement fermées ou des « respiromètres » (ci-après dénommés « chambres »), où la variation d’oxygène est mesurée à l’aide d’optodes3. Les optodes sont des sondes qui mesurent la concentration en oxygène à l’aide d’impulsions lumineuses, et l’enregistrement des mesures dans le temps permet de calculer les taux de respiration et/ou de photosynthèse. En pratique, la mesure de la respiration est similaire à la mesure de la photosynthèse chez les coraux, sauf que les coraux sont incubés dans l’obscurité totale. En soustrayant la respiration quotidienne totale du corail et des symbiotes de la photosynthèse quotidienne totale, on obtient un différentiel d’oxygène (delta d’oxygène)2,3. En général, les organismes utilisent plus d’oxygène qu’ils n’en produisent, ce qui entraîne un déficit. Cela peut être converti en équivalents carbone puisque l’oxygène et le carbone sont consommés dans un rapport fixe2. L’excédent de carbone peut être utilisé par le corail pour la croissance, la synthèse et la reproduction du mucus, et d’autres besoins métaboliques essentiels12.
Ce protocole décrit une méthode de micro-respiration (figure 1) qui a été utilisée pour mesurer les taux de respiration (R) pour des juvéniles de corail individuels à l’aide d’une chambre en verre de 1,5 mL sur mesure (flacon avec filetage GL25 et 20 mm de haut, avec bosse/crête, rebord plat et bouchon à vis avec trou ; voir le tableau des matériaux) rempli d’eau de mer filtrée de 0,5 μm. Des optodes à fibre optique (voir Tableau des matériaux) ont été insérés dans chaque chambre par un trou sur le côté du couvercle. Chaque corail individuel était attaché au-dessus d’une plate-forme d’agitateur à mailles dures et à circulation au-dessus d’un agitateur magnétique pour assurer un mélange adéquat de l’eau dans la chambre. Dans l’exemple représentatif ici, deux témoins ou « blancs » (chambres identiques à l’exception de la présence de l’échantillon) ont été mesurés simultanément aux trois chambres d’échantillons répétés, car nous avions plusieurs contrôleurs fonctionnant simultanément. Cependant, l’exemple de configuration (Figure 2) ne montre que l’utilisation de quatre canaux ; Cela peut être augmenté en utilisant plusieurs contrôleurs et plusieurs supports à flux continu. La température peut également être contrôlée dans ce système en immergeant chaque chambre dans un bain-marie sur mesure avec des températures d’eau prédéfinies (27 °C pour le contrôle ou 31 °C pour la contrainte thermique élevée dans les exemples de données ici) à l’aide d’un système de recirculation (débit continu et doux réglé à 75 L/h). La plate-forme de plaque d’agitation et la plaque d’agitation avec engrenages peuvent être de n’importe quelle taille et peuvent être aussi grandes ou aussi petites que nécessaire pour accueillir le nombre de chambres en verre. Dans cet exemple, la plate-forme et la plaque mesuraient environ 34 cm x 26 cm x 3 cm (Table des matériaux). L’étalonnage des optodes a été effectué avant chaque essai à l’aide de deux solutions étalons représentant une saturation en oxygène de 0 % et 100 % à la température et à la salinité de l’eau appropriées pour ce cadre expérimental.
Ce travail décrit la construction d’un dispositif de micro-respirométrie sur mesure qui peut être utilisé pour quantifier la quantité d’oxygène consommée et produite par les petits organismes aquatiques sessiles. Les composants critiques de ce protocole comprennent la mise en place des chambres, y compris les spots, et l’étalonnage du signal faible à l’aide du package respR , dans lequel un signal faible peut être défini comme des taux caractérisés par des pentes peu profondes ou bruyantes. La chambre personnalisée et sa configuration permettent de détecter même les signaux faibles, tandis que l’utilisation du package R permet de se prémunir contre les problèmes dans lesquels l’apparition de pentes peu profondes ou bruyantes pourrait entraîner une mauvaise interprétation des résultats (par exemple, des faux positifs).
Les modifications potentielles qui seront nécessaires pour d’autres utilisateurs comprennent la sécurisation de l’organisme d’intérêt dans la chambre sur mesure. Dans ce cas, une petite attache rigide et de la colle d’aquarium ont été utilisées pour fixer le juvénile à la base en plastique, qui a ensuite été collée à l’attache. Il est à noter que, pour cette expérience, les juvéniles de corail ont été installés sur des bâches en plastique noir. Ce plastique a permis de retirer facilement les juvéniles de corail, qui ont effectivement glissé du plastique, afin de ne pas les blesser physiquement pendant le retrait. Les juvéniles de corail se fixent sur le substrat sur lequel ils s’installent, il est donc recommandé de les déposer sur une matière plastique similaire, en utilisant un peptideartificiel 16 pour faciliter leur élimination pour le processus de collage. Pour minimiser davantage le stress lié à la manipulation et l’impact sur la réponse respiratoire, il est recommandé de laisser les coraux montés sur des attaches zippées s’acclimater pendant 1 à 2 semaines, comme c’est souvent le cas dans de nombreuses expériences de stress sur les coraux adultes. D’autres modifications peuvent être nécessaires pour fixer l’organisme au-dessus de l’endroit dans le couvercle et pour permettre la circulation de l’eau. Une autre étape clé du dépannage consiste à détecter les signaux, en particulier sur la pente de la série temporelle d’oxygène où les taux doivent être déterminés. En fin de compte, cela se résume à une combinaison de l’utilisation d’un bon jugement pour exclure les données manifestement instables, et des fonctions de respR pour permettre d’extraire les taux des régions choisies de manière cohérente ou automatiquement en identifiant les régions linéaires des données. D’autres exemples de la façon de procéder sont disponibles sur le site Web du respR .
Cette méthode a été développée pour étendre les mesures de la limite inférieure de la respiration à des invertébrés marins sessiles extrêmement petits. La limite évidente est que ce protocole peut être plus sujet aux faux positifs que les protocoles conçus pour des biomasses plus importantes. Cependant, étant donné que c’était le but de la conception – mesurer ces limites inférieures – cela a été pris en compte dans la conception, et la procédure peut être utilisée avec le package respR pour mieux se prémunir contre les faux positifs. Il est également important de reconnaître qu’il existe d’autres systèmes pour mesurer la respiration30 et la mesure de petits organismes, y compris la respirométrie sur des copépodes individuels31 dans des volumes plus petits que celui-ci (~0,5-1 mL), mais qu’ils sont soit coûteux, soit dépourvus de composants spécifiques (capacité d’agitation). Cependant, ce système est open source et relativement peu coûteux par rapport aux systèmes commerciaux (par exemple, le système Core Microplate). Ce système intègre également des considérations méthodologiques clés telles que l’agitation, ce qui peut manquer à d’autres systèmes. La fonction de barre d’agitation interne est essentielle pour reproduire le mélange naturel de l’eau de nombreux organismes marins (par exemple, les copépodes par la nage), ce qui n’est souvent pas possible et peut rendre les données largement inutilisables. En revanche, d’autres méthodes de mélange disponibles consistent à placer l’ensemble du respiromètre sur un banc à bascule géant, ce qui nécessite un équipement supplémentaire et a un succès limité dans le mélange, ou le mélange par vibration, ce qui peut perturber l’organisme. Pour cette raison, c’est le seul système capable d’effectuer une respirométrie sur des coraux juvéniles ou d’autres très petits organismes sessiles. À titre de référence, la gamme de tailles des spécimens inclus ici variait de 2,1 à 3,6 polypes (correspondant à seulement quelques mois), avec une surface moyenne minimale à maximale de 1,3 à 4,5 mm2.
La respirométrie est une mesure fondamentale dans les études écologiques, et de nombreuses méthodes existent à cette fin. La plupart de ces méthodes existantes ciblent cependant des échantillons à forte biomasse, y compris des poissons entiers, des fragments de corail ou des herbiers marins 32,33,34. Cette méthode est la première à utiliser des juvéniles de corail individuels. De plus, il existe de nombreuses applications potentielles pour cette méthode, car elle fournit des informations physiologiques clés sur le fonctionnement de l’organisme. Cela peut être important pour les études visant à caractériser les estimations de base de la santé35, à comprendre le rôle du stress aigu ou à long terme pendant l’ontogenèse corallienne comme le stress thermique36, ou à fournir des seuils que les gestionnaires peuvent fixer pour aider à protéger et à améliorer la santé des récifs coralliens37. Étant donné que le corail est un holobionte et que la communauté symbiotique est relativement flexible à ce stade et tout au long de la première année de vie38, il serait intéressant de coupler les données de respirométrie avec les changements dans les communautés au fil du temps, afin de contextualiser pleinement le fonctionnement de l’organisme dans son ensemble. Il est important de noter que cette méthode contribue aux techniques de « science ouverte » qui aident à fournir un aperçu pour la création de configurations expérimentales personnalisées qui peuvent être partagées, améliorées et standardisées ouvertement.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Sam Noonan pour son aide et ses conseils, Sven Uthicke pour l’utilisation des chambres de respirométrie initiales, Ben Shelab pour son illustration d’ingénierie et l’atelier de l’Institut australien des sciences de la mer pour l’usinage sur mesure des adaptateurs et des supports de chambre de respirométrie. Les coraux ont été collectés en vertu du permis suivant du parc marin de la Grande Barrière de corail à AIMS G12/ 35236.1. Les coraux ne nécessitent pas de permis éthiques.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |