Este protocolo descreve a configuração e funcionamento de um sistema de micro-respirometria que pode ser empregado para investigar as características fisiológicas do holobionte coral.
A atividade metabólica, definida como a soma dos processos do organismo que envolvem energia, é de fundamental importância para a compreensão da função e evolução da vida na Terra. A medição das taxas metabólicas dos organismos está, portanto, no centro da explicação dos estados fisiológicos dos organismos, seus papéis ecológicos e o impacto das mudanças ambientais nas espécies dentro dos ecossistemas terrestres e aquáticos. Nos recifes de coral, medidas do metabolismo têm sido usadas para quantificar o funcionamento da simbiose entre corais e seus simbiontes algais obrigatórios (Symbiodiniaceae), bem como avaliar como os estressores ambientais, incluindo as mudanças climáticas, afetarão a saúde dos corais. Apesar dessa significância, há uma carência de métodos e, portanto, de dados relacionados às medidas da taxa metabólica em filhotes de coral, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho. Para suprir essa lacuna, este estudo teve como objetivo desenvolver uma configuração personalizada para medir a respiração de pequenas ecologias de animais marinhos (faixa de tamanho milimétrico). Esse baixo custo e fácil configuração deve permitir uma melhor mensuração da taxa metabólica. Isso será essencial para pesquisas ecológicas aplicadas utilizando a produção sexuada de corais para restauração recifal.
A respiração é uma medida biológica crítica que sinaliza a atividade metabólica global de um organismo, mas, como outras características críticas (crescimento), é difícil de medir em organismos pequenos1. A respiração pode ser definida como a oxidação de moléculas orgânicas através do uso de oxigênio. Esse processo gera a energia química necessária para a função celular (ou seja, o metabolismo), que é essencial para a sobrevivência dos organismos. Alternativamente, o metabolismo anaeróbio resulta em débito de oxigênio2. As taxas respiratórias podem ser determinadas usando optodes que medem o uso (e, portanto, a diminuição) da concentração de oxigênio ao longo do tempo em uma câmara fechada, uma prática geralmente conhecida como respirometria3. Dado que a maioria dos organismos não armazena oxigênio, a taxa de metabolismo pode ser inferida através da correlação direta entre respiração e uso de carbono. Devido a isso, as taxas respiratórias podem ser convertidas para o uso diário de carbono, que informa funções metabólicas críticas, como crescimento, reprodução e a capacidade de manter a homeostase metabólica durante períodos de estresse ambiental 4,5, incluindo condições de ondas de calor que geralmente levam ao estresse ou branqueamento nos corais.
Os recifes de coral estão diminuindo globalmente em um ritmo acelerado. O animal coral abriga um consórcio de parceiros (incluindo o dinoflagelado Symbiodiniaceae, fungos, bactérias e vírus), coletivamente referido como “holobionte”6. À medida que a temperatura dos oceanos aumenta, os corais e, portanto, os recifes de coral, estão sob crescente pressão para sobreviver, pois as altas temperaturas levam à perda do dinoflagelado Symbiodiniaceae (doravante simbiontes), fenômeno conhecido como branqueamento7. Muitos nutrientes não estão disponíveis para os corais em águas tropicais oligotróficas, incluindo nitrogênio inorgânico e fósforo8. Para o enfrentamento, os corais formam uma simbiose nutricional obrigatória com seus simbiontes dinoflagelados (Symbiodiniaceae), que fornecem a maioria dos nutrientes necessários para que o hospedeiro coral sobreviva e deposite seus esqueletos de carbonato de cálcio9. Uma simbiose funcional pode ser caracterizada por altos níveis de compartilhamento de carbono entre parceiros 10,11, e a regulação da simbiose envolve uma homeostase dinâmica12.
Durante o estresse térmico, essa regulação dinâmica e comunicação são interrompidas, resultando em disbiose e clareamento (revisado na referência13). Medidas metabólicas, como fotossíntese e respiração, portanto, têm o potencial de elucidar os estados disbióticos saudáveis e não regulados dos corais, e medir com precisão esses processos através da ontogenia é fundamental para entender o funcionamento do organismo. Isso é particularmente importante à medida que a frequência e a magnitude dos eventos de branqueamento em massa aumentam, com o potencial de influenciar mudanças no compartilhamento de nutrientes dos simbiontes, onde a transferência de carbono diminui com o aumento das temperaturas14. Isso pode ser devido a mecanismos direcionados pelo sequestro simbionte de nutrientes ou a trade-offs fisiológicos difíceis (aumento da tolerância térmica, mas diminuição da sobrevivência do hospedeiro 15,16,17). Rupturas na simbiose podem decorrer tanto do simbionte quanto do hospedeiro, embora um fator preponderante seja provavelmente o mau funcionamento celular do simbionte18. No entanto, o estresse causado pelo aumento da temperatura da água do mar desestabiliza essa simbiose; O compartilhamento de carbono do simbionte para o hospedeiro é diminuído19,20, e a fome do coral pode ocorrer. Isso pode ser refletido na diminuição dos estoques de lipídios e carboidratos nos corais devido ao aumento do uso do hospedeiro (“aumento do catabolismo do carbono fixo”), provavelmente devido à diminuição do compartilhamento pelos simbiontes11. Ao lado da contribuição da fotossíntese e da respiração dos simbiontes dos corais, a respiração do animal coral é uma medida importante para entender a saúde dos corais, os impactos do branqueamento e da troca de nutrientes entre esses parceiros e o crescimento do holobionte, fenótipo relevante para sobreviver às mudanças ambientais 8,21,22. Finalmente, dado que muitos corais são simbióticos, o uso da respirometria para caracterizar a fotossíntese além da respiração é particularmente útil para contextualizar as razões P:R e entender se a simbiose é estável ou não (por exemplo, referência23).
As mudanças ambientais, portanto, causam mudanças nos orçamentos energéticos dos corais e seus simbiontes, levando a diferenças no crescimento14. Para lidar, o hospedeiro coral pode aumentar a respiração e o uso de lipídios para atender às suas demandas metabólicas; O estresse térmico pode reduzir a produtividade líquida em 60% devido a esse aumento da respiração14, medido por uma mudança no oxigênio dissolvido. Symbiodiniaceae também pode aumentar a assimilação de nitrogênio e a retenção de carbono14,24 e, então, utilizar essas reservas para deslocar energia para seus próprios mecanismos de reparo e proteção25,26. O balanço de N e C é importante para regular o crescimento, e o P em particular27, que pode se manifestar como uma regulação dinâmica da abundância de simbiontes. De fato, evidências coletadas de corais em grandes extensões recifais (>1.000 km) sugerem que os hospedeiros têm a capacidade de limitar o crescimento simbionte por meio da regulação do P, embora isso varie de acordo com a espécie de coral27.
Em conjunto, esses estudos sugerem um ganho de tolerância ao calor com uma diminuição concomitante na produção ou translocação de nutrientes (ou seja, a propensão à simbiose) devido a mudanças ambientais. Métodos potentes unijuvenis, como a quantificação do uso de oxigênio via microrrespirometria, devem, portanto, ser usados para entender os mecanismos fundamentais relacionados ao metabolismo e, em seguida, aplicados a questões de conservação, como a compreensão da aquisição de tolerância ao calor. Esta é apresentada aqui como uma ferramenta de micro-respirometria para medidas fisiológicas, destinada a consultar a relação nutricional entre juvenis de corais e seus simbiontes algais, mas adequada para outros pequenos organismos marinhos.
O uso ou a produção de oxigênio pelos organismos pode ser medido colocando-os em câmaras de respirometria individuais hermeticamente fechadas ou “respirômetros” (doravante câmaras), onde a mudança de oxigênio é medida usando optodes3. Optodes são sondas que medem a concentração de oxigênio usando pulsos de luz, e registrar medições ao longo do tempo permite o cálculo das taxas de respiração e/ou fotossíntese. Na prática, medir a respiração é semelhante a medir a fotossíntese em corais, exceto que os corais são incubados na escuridão total. Subtraindo a respiração diária total dos corais e simbiontes da fotossíntese diária total resulta em um diferencial de oxigênio (delta de oxigênio)2,3. Geralmente, os organismos usam mais oxigênio do que produzem, resultando em um déficit. Isso pode ser convertido em carbono equivalente, uma vez que o oxigênio e o carbono são consumidos em uma razão fixa2. O excedente de carbono pode ser utilizado pelo coral para crescimento, síntese e reprodução de muco e outras necessidades metabólicas essenciais12.
Este protocolo descreve um método de micro-respiração (Figura 1) que foi empregado para medir as taxas de respiração (R) para juvenis de coral individuais usando um design de câmara de vidro personalizado de 1,5 mL (frasco com rosca GL25 e 20 mm de altura, com solavanco/crista, borda plana e tampa de rosca com furo; ver Tabela de Materiais) preenchida com água do mar filtrada de 0,5 μm. Os optodes de fibra óptica (ver Tabela de Materiais) foram inseridos em cada câmara através de um orifício na lateral da tampa. Cada coral individual foi fixado acima de uma plataforma de placa de agitação de malha dura, fluída, acima de uma barra de agitação magnética para garantir a mistura adequada de água dentro da câmara. No exemplo representativo aqui, dois controles ou “blanks” (câmaras que eram idênticas, exceto pela presença do espécime) foram medidos simultaneamente às três câmaras de réplica do corpo de prova, pois tínhamos vários controladores funcionando simultaneamente. No entanto, o exemplo de configuração (Figura 2) mostra apenas o uso de quatro canais; Isso pode ser aumentado usando vários controladores e vários suportes de fluxo. A temperatura também pode ser controlada neste sistema submergindo cada câmara em banho-maria personalizado com temperaturas de água predefinidas (27 °C para controle ou 31 °C para o estresse de alta temperatura nos dados de exemplo aqui) usando um sistema de fluxo recirculante (fluxo contínuo e suave definido em 75 L/h). A plataforma da placa do agitador e a placa do agitador com engrenagens podem ser de qualquer tamanho e podem ser feitas tão grandes ou tão pequenas quanto necessário para acomodar o número de câmaras de vidro. Neste exemplo, a plataforma e a placa tinham cerca de 34 cm x 26 cm x 3 cm (Tabela de Materiais). A calibração dos optodes foi realizada antes de cada corrida usando duas soluções-padrão representando 0% e 100% de saturação de oxigênio na temperatura e salinidade da água adequadas para este cenário experimental.
Este trabalho descreve a construção de um sistema de micro-respirometria feito sob medida que pode ser usado para quantificar a quantidade de oxigênio consumido e produzido por pequenos organismos aquáticos sésseis. Os componentes críticos deste protocolo incluem a configuração das câmaras, incluindo os pontos, e a calibração do sinal baixo usando o pacote respR , no qual um sinal baixo pode ser definido como taxas tipificadas por inclinações rasas ou ruidosas. A câmara personalizada e sua configuração permitem a detecção de sinais ainda baixos, enquanto o uso do pacote R ajuda a proteger contra problemas em que a ocorrência de inclinações rasas ou barulhentas pode levar à interpretação errônea dos resultados (por exemplo, falso-positivos).
Possíveis modificações que serão necessárias para outros usuários incluem a segurança do organismo de interesse dentro da câmara personalizada. Neste caso, uma pequena gravata rígida e cola de aquário foram usadas para prender o único jovem à base plástica, que foi então colada na gravata. Deve-se notar que, para este experimento, os juvenis de coral foram assentados em lonas plásticas pretas. Este plástico permitiu a fácil remoção dos juvenis de coral, que efetivamente deslizaram para fora do plástico, de modo a não prejudicá-los fisicamente durante a remoção. Os juvenis de corais se afixam ao substrato em que se instalam, por isso recomenda-se assentá-los em material plástico semelhante, usando um peptídeo artificial16 para facilitar sua remoção para o processo de colagem. Para minimizar ainda mais o estresse de manuseio e o impacto na resposta respiratória, recomenda-se permitir que os corais montados em zíperes se aclimatem por 1-2 semanas, como é comum em muitos experimentos de estresse de corais adultos. Outras modificações podem ser necessárias para fixar o organismo acima do ponto na tampa e permitir a circulação de água. Outra etapa importante de solução de problemas envolve a detecção de sinal, especificamente na inclinação da série temporal de oxigênio, onde as taxas devem ser determinadas. Em última análise, isso se resume a uma combinação de usar o bom senso para excluir dados obviamente instáveis e as funções dentro do respR para permitir que as taxas sejam extraídas de regiões escolhidas consistentemente ou automaticamente identificando regiões lineares dos dados. Outros exemplos de como fazer isso estão disponíveis no site da respR .
Este método foi desenvolvido para estender as medidas do limite inferior da respiração a invertebrados marinhos extremamente pequenos e sésseis. A limitação óbvia é que este protocolo pode ser mais propenso a falso-positivos em comparação com protocolos projetados para biomassas maiores. No entanto, dado que este era o ponto do projeto – para medir esses limites inferiores – isso foi levado em consideração no projeto, e o procedimento pode ser usado com o pacote respR para melhor proteger contra falso-positivos. Também é importante reconhecer que existem outros sistemas para medir a respiração30 e a medição de pequenos organismos, incluindo a respirometria em copépodes individuais31 em volumes menores do que este (~0,5-1 mL), mas são caros ou carecem de componentes específicos (capacidade de agitação). No entanto, este sistema é de código aberto e de custo relativamente baixo em comparação com sistemas comerciais (por exemplo, sistema Core Microplate). Esse sistema também incorpora considerações metodológicas importantes, como a agitação, que outros sistemas podem não ter. O recurso de barra de agitação interna é essencial para replicar a mistura natural de água de muitos organismos marinhos (por exemplo, copépodes através da natação), que muitas vezes não é possível e pode tornar os dados em grande parte inutilizáveis. Em contraste, outros métodos de mistura disponíveis envolvem a colocação de todo o respirômetro em um banco balancim gigante, que requer equipamento adicional e tem sucesso limitado na mistura, ou mistura via vibração, o que pode causar distúrbios ao organismo. Por esta razão, este é o único sistema que pode realizar a respirometria em corais juvenis ou outros organismos sésseis muito pequenos. Para referência, a faixa de tamanho dos espécimes aqui incluídos variou de 2,1 a 3,6 pólipos (correspondendo a apenas alguns meses de idade), com área média mínima a máxima de 1,3 a 4,5mm2.
A respirometria é uma medida fundamental em estudos ecológicos, e muitos métodos existem para esse fim. A maioria desses métodos existentes, no entanto, visa amostras de alta biomassa, incluindo peixes inteiros, fragmentos de corais ou ervas marinhas 32,33,34. Este método é o primeiro a usar juvenis de coral individuais. Além disso, existem muitas aplicações potenciais para este método, uma vez que fornece informações fisiológicas fundamentais sobre o funcionamento do organismo. Isso pode ser importante para estudos que procuram caracterizar estimativas de saúde basais35, entender o papel do estresse agudo ou de longo prazo durante a ontogenia dos corais, como o estresse térmico36, ou fornecer limiares que os gestores podem definir para ajudar a proteger e melhorar a saúde dos recifes de coral37. Dado que o coral é um holobionte e a comunidade simbionte é relativamente flexível nesta fase e ao longo do primeiro ano de vida38, seria interessante combinar dados de respirometria com mudanças nas comunidades ao longo do tempo, para contextualizar completamente o funcionamento do organismo como um todo. É importante ressaltar que esse método contribui para técnicas de “ciência aberta” que ajudam a fornecer um esboço para a criação de configurações experimentais personalizadas que podem ser compartilhadas, melhoradas e padronizadas abertamente.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Sam Noonan por sua ajuda e conselhos, Sven Uthicke pelo uso das câmaras de respirometria iniciais, Ben Shelab por sua ilustração de engenharia e ao workshop do Instituto Australiano de Ciências Marinhas para usinagem sob medida de adaptadores e suportes de câmaras de respirometria. Os corais foram coletados sob a seguinte licença do Parque Marinho da Grande Barreira de Corais para AIMS G12/ 35236.1. Os corais não exigem autorização ética.
Cost | |||
(1.1 – 1.6) Custom respirometry chambers | LabGlass Party Ldt. | 1.5 ml | $407.26 |
1.1 lids | AIMS workshop | Vial GL25 thread | ~$10 |
1.2 fiber-optics spots (FireStingO2 II fiberoptic optodes) | PyroScience | Oxygen sensor spots, 125 µm PET foil, Ø5 mm, with optical isolation, SN: 183801947 | $41.25 AUD each |
1.3 individual organism | NA | NA | NA |
1.4 flow-through stand | AIMS workshop | Custom | included in points 5 and 6 price (the workshop gave me an estimate of the lids, stand with gears, motor, incubation flow through |
1.5 magnetic stirrer | Any manufactuer is suitable | NA | ~$2? |
1.6 glass chamber (vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole, Labglass Pty Ltd, Stafford QLD) | Labglass Pty Ltd, Stafford QLD | Vial GL25 thread x 20 mm high, with bump/ridge, flat-ground rim, screw cap with hole | $50.9 AUD |
2 FireSting controller (2) | PyroSciences | NA | 4 sensors is 4000 Euros. 8 sensors used here. |
3 computer | NA | NA | NA |
4 heater/chiller | VWR International | NA | Small models around $4,000 AUD |
5 respirometry plate platform | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm (although any dimensions are adequate to fit desired number of chambers) | $1250 AUD |
6 stirrer plate with gears (7) | AIMS workshop | 34 cm x 26 cm x 3 cm | $1250 AUD |
8 powered by the motor | AIMS workshop | Custom | $700 AUD |
9 power supply | Non-specific | NA | ~$300 AUD |
Aquarium glue | Seachem reef glue | 20g | $14 |
Oxygen Logger Software | PyroScience | NA | NA |
Polypipe and connectors | John Guest | NA | $20 |
Sodium Sulfite | Sigma | S0505-250G (CAS number 7757-83-7) | $54 |