Summary
Vi beskriver en enkel og effektiv metode til at isolere celler i retinale pigmentepitelceller (RPE) fra øjnene på unge pigmenterede marsvin. Denne procedure giver mulighed for opfølgende molekylærbiologiske undersøgelser af den isolerede RPE, herunder genekspressionsanalyser.
Abstract
Denne protokol beskriver isoleringen af celler i retinale pigmentepitel (RPE) fra øjnene på unge pigmenterede marsvin med henblik på potentiel anvendelse i molekylærbiologiske undersøgelser, herunder genekspressionsanalyser. I forbindelse med øjenvækstregulering og nærsynethed spiller RPE sandsynligvis en rolle som et cellulært relæ for vækstmodulerende signaler, da det er placeret mellem nethinden og øjets to vægge, såsom choroid og sclera. Mens protokoller til isolering af RPE er blevet udviklet til både kyllinger og mus, har disse protokoller vist sig ikke at være direkte oversættelige til marsvinet, som er blevet en vigtig og udbredt pattedyrsnærsynethedsmodel. I denne undersøgelse blev molekylærbiologiske værktøjer brugt til at undersøge ekspressionen af specifikke gener for at bekræfte, at prøverne var fri for forurening fra de tilstødende væv. Værdien af denne protokol er allerede blevet demonstreret i et RNA-Seq-studie af RPE fra unge pigmenterede marsvin udsat for nærsynethedsinducerende optisk defokusering. Ud over regulering af øjenvækst har denne protokol andre potentielle anvendelser i undersøgelser af retinale sygdomme, herunder myopisk makulopati, en af de førende årsager til blindhed hos myopes, hvor RPE har været impliceret. Den største fordel ved denne teknik er, at den er relativt enkel og en gang perfektioneret, giver RPE-prøver af høj kvalitet, der er egnede til molekylærbiologiske undersøgelser, herunder RNA-analyse.
Introduction
RPE består af et unikt monolag af pigmenterede celler placeret mellem neuralhinden og den vaskulære choroid, og RPE har velkendte roller i udviklingen og vedligeholdelsen af normal nethindefunktion, herunder fototransduktion 1,2. For nylig er RPE blevet tildelt en yderligere nøglerolle i øjenvækstregulering3 og dermed udviklingen af nærsynethed4. Denne opgave er baseret på RPE'ens kritiske placering, indskudt mellem nethinden og choroid og den nu brede accept af, at øjenvækst og dermed brydningsfejl reguleres lokalt5. RPE menes at spille en nøglerolle som et signalrelæ, der forbinder nethinden, den formodede kilde til vækstmodulerende signaler, til choroid og sclera, de to mål for de videresendte signaler 6,7,8.
Stigningen i aksial længde, der karakteriserer de fleste nærsynethed, kan ikke betragtes som godartet, med patofysiologiske ændringer, der involverer nethinden, choroid og / eller sclera, der repræsenterer uundgåelige og nu velkendte konsekvenser af overdreven okulær forlængelse 7,9. I denne sammenhæng er RPE måske den mest sårbare, da den som et ikke-mitotisk væv kun er i stand til at rumme det ekspanderende glaslegemekammer ved strækning og udtynding af individuelle celler. Mens dets rolle i nærsynethedsrelaterede patologier, såsom myopisk makuladegeneration, endnu ikke er fuldt ud forstået, har RPE været impliceret i patogenesen af en række andre retinale sygdomme, herunder geografisk atrofi, en af de førende årsager til blindhed, som er forbundet med dokumenterede abnormiteter i nethinden, RPE og choroid10,11, 12.
Den vellykkede isolering af RPE-celler, fri for kontaminering fra tilstødende okulært væv, åbner potentielt mange forskningsmuligheder for at få ny indsigt i mekanismerne bag en række øjen- / nethindesygdomme. Imidlertid har isoleringen af RPE vist sig udfordrende, med mange offentliggjorte undersøgelser, der gør brug af kombinerede nethinden / RPE eller RPE / choroidprøver af denne grund13,14,15. Undersøgelser, der indebærer en vellykket isolering af RPE af en kvalitet, der er egnet til molekylærbiologiske undersøgelser, har været begrænset til kyllinge- og museøjne16,17. For eksempel den samtidige RPE-isolation og RNA-stabilisering (SRIRS) metode beskrevet af Wang et al.18. At isolere RPE-celler i mus ser ikke ud til at fungere godt i marsvinøjne. Protokollen, der beskrives her, repræsenterer en forfining af en tilgang, der oprindeligt blev prototypet med træskårne øjne af en af forfatterne (MF) og har vist sig at give RPE-prøver af høj kvalitet, der er egnede til RNA og andre molekylærbiologiske analyser, fra øjnene på unge pigmenterede marsvin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrepleje og behandlinger, der blev anvendt i denne undersøgelse, var i overensstemmelse med ARVO-erklæringen for brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Animal Care and Use Committee ved University of California, Berkeley.
1. Enucleation af marsvinøjet
- Aflive et marsvin med en intrakardial injektion af natriumpentobarbital leveret under anæstesi (5% isofluran i ilt).
- Enucleate øjnene ved hjælp af tang og saks, og overfør dem straks til en 10 cm petriskål med sterilt fosfatbufret saltvand (PBS) til vask. Overfør øjnene til frisk PBS-opløsning.
BEMÆRK: En 6-brønds plade indeholdende 4 ml opløsning pr. brønd anbefales.
2. Isolering af okulær bageste øjenkop og RPE / choroid / sclera kompleks
- Ved hjælp af et dissekerende mikroskop anvendes en 18 G nål til at lave et indledende lille snit i scleraen, ca. 1,0 mm bag limbalgrænsen (dvs. mellem hornhinden og sclera) (figur 1A); Brug derefter en saks til at fjerne det forreste segment, herunder hornhinden, iris, ciliærlegemet og krystallinsk linse.
- Derefter skal du arbejde med det resterende bageste okulære segment øjenkop, løsne nethinden fra RPE / choroid / sclera-komplekset; Brug tang til først at gribe fat og derefter forsigtigt trække i zonulen af Zinn og derefter gradvist skrælle nethinden væk uden fragmentering (figur 1B).
BEMÆRK: Nethinden må ikke gribes direkte for at undgå retinal fragmentering og ufuldstændig retinal vævsisolering. Brug af et mikroskop er afgørende for dette dissektionstrin.
3. Isolering af RPE fra choroid
- Når nethinden er helt fjernet, nedsænkes den resterende bageste øjenkop, som inkluderer RPE, choroid og sclera, i vævsopbevaringsreagens i 5 minutter (se materialetabellen).
BEMÆRK: Brug en plade med 12 brønde med identificerede huller, hver fyldt med 2 ml vævsopbevaringsreagenset. - Overfør øjenkoppen til en anden brønd fyldt med 4 ml PBS i 10 sekunder, før du flytter den til en tredje brønd fyldt med 2 ml PBS.
- Sæt en 30 G kanyle på en 1 ml sprøjte fyldt med PBS til det sidste RPE-isolationstrin. Tryk forsigtigt på sprøjten for at skabe en jetstrøm af PBS; Ret først denne strøm mod RPE for at lave en lille tåre eller hul i den, og ret derefter strømmen af PBS ind i den oprettede åbning for at løsne RPE som et ark fra choroid (figur 1C).
BEMÆRK: Løsningen af RPE som et ark giver den største RPE-prøve. Igen er brugen af et mikroskop afgørende for dette trin. - Efter løsrivelse af RPE fra choroid (figur 1D) opsamles RPE-vævet i en nåleløs 1 ml sprøjte, og den opsamlede prøve overføres derefter til et 1,5 ml rør.
- Centrifuger 1,5 ml røret med den opsamlede RPE ved 8.000 × g i 1 min for at opnå en RPE-pellet (figur 2A).
- Kassér PBS-opløsningen, og erstat den med 350 ml lysisbuffer, som inkluderet i RNA-isolationssæt (se materialetabellen); pipette 20x for at blande og dermed bevare prøvens kvalitet. Ved længerevarende opbevaring og konservering overføres prøverne til en -80 °C fryser.
BEMÆRK: Lysisbufferen er en proprietær komponent i RNA-isolationssættet til celle- og vævslyse før RNA-isolering og samtidig RNA / DNA / proteinisolering. For at inaktivere RNA'erne i lysatet skal du sørge for at tilføje β-mercaptoethanol til lysisbufferen (10 μL β-mercaptoethanol pr. 1 ml lysisbuffer).
4. RPE-RNA-ekstraktion
- Brug et RNA-isolationssæt (se materialetabellen) til at isolere og opsamle RNA'et fra RPE-prøverne efter producentens anvisninger. Evaluer kvaliteten af prøven via elektroforese.
BEMÆRK: Den beskrevne protokol gav et produkt af god kvalitet (dvs. RNA-integritetsnummer [RIN] over 8,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen af RPE-prøverne indsamlet ved hjælp af ovenstående protokol viste velbevaret RNA (RIN >8,0, figur 2B) med 240,2 ng ± 35,1 ng pr. øje (n = 8, NanoDrop, figur 2B). For yderligere at evaluere kvaliteten af de isolerede RPE-prøver, især fraværet af choroidale og scleral kontaminanter, undersøgte vi ekspressionen af repræsentative gener for hvert af sidstnævnte væv i RPE-prøverne19. RPE-prøverne viste en signifikant højere ekspression af Rpe65 (et RPE-specifikt gen) sammenlignet med Rpe65-ekspressionsniveauerne i choroid og sclera (tabel 1 og figur 2C). I modsætning hertil viste RPE-prøverne minimal ekspression af Col1a1, det udvalgte choroid-sclera-specifikke gen (figur 2D).
Figur 1: Procedure for indsamling af RPE-arkene . A) Et 2 uger gammelt marsvineøje med det første snit. (B) Det forreste segment (hornhinde, iris og linse), glaslegeme og nethinden adskilles derefter fra den bageste øjenkop (RPE, choroid og sclera). (C) En jetstrøm af PBS, leveret via en 30 G nål, anvendes løsne RPE (D) som et ark (sorte pile) fra choroid. Proceduren fra det første snit til RPE-samlingen tager 5-7 min. Forkortelse: RPE = retinal pigmentepitel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procedure til vurdering af kvaliteten af de isolerede RPE-prøver. (A) Repræsentativt billede af en RPE-prøve i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas efter nedspundning. B) Repræsentativt bioanalysatoroutput for RNA ekstraheret fra de indsamlede RPE-prøver. (C,D) Genekspressionsniveauerne for Rpe65, et RPE-specifikt gen, og Col1a1, som ikke eller minimalt udtrykkes i RPE, målt ved RT-qPCR i RPE-, choroid- og scleralprøver fra n = 3 ubehandlede dyr; Begge datasæt blev normaliseret til β-actin. ** P < 0,01; P < 0,001. Dette tal er ændret fra Goto et al.19. Forkortelser: RPE = retinal pigmentepitel; β-actin = beta-actin; Col1a1 = kollagen type-I alfa-1 kæde; Rpe65 = retinoid isomerohydrolase; RT-qPCR = kvantitativ polymerasekædereaktion med omvendt transkription. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Gen | Fremadgående primer (5' til 3') | Omvendt primer (5' til 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-actin | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabel 1: Nukleotidsekvenser af de primere, der anvendes til PCR-amplifikation i prøvekvalitetsanalysen. Forkortelser: β-actin = Beta-actin; Col1a1 = kollagen type I alfa 1 kæde; Rpe65 = retinoid isomerohydrolase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel beskriver vi en metode til isolering af RPE, velegnet til RPE-genekspressionsanalyser, fra øjnene på unge, pigmenterede marsvin. Fordelene ved denne protokol er, at den giver RPE-prøver af høj kvalitet, der er relativt fri for kontaminering, med RNA, der er passende bevaret til RNA-specifikke analyser, og alligevel er den relativt enkel og effektiv. Mens RPE-prøverne i eksemplet her blev indsamlet fra øjnene på et ungt (2 uger gammelt) marsvin, er protokollen også blevet brugt med succes til at indsamle RPE-prøver fra ældre (unge voksne) dyr.
For forskere med minimal tidligere erfaring med okulær kirurgi eller dissektion kan protokoltrin 2.1 og trin 2.2 være udfordrende. Den kritiske detalje i trin 2.1 er placeringen af det indledende snit i scleraen, som skal placeres nøjagtigt 1,0 mm bag limbussen, så iris og linse fjernes sammen med hornhinden, når det forreste segment løsnes. Hvis iris i stedet forbliver fastgjort til det bageste okulære segment, er det udfordrende at finde zonulen af Zinn, hvilket er nøglen til succesfuldt at løsne nethinden i næste trin. Som nævnt i protokollen er det også afgørende for en vellykket løsrivelse af nethinden, at nethinden ikke gribes direkte med tangen for at undgå fragmentering. Marsvinets nethinden ser mere skrøbelig ud end musens nethinden, sandsynligvis på grund af dens avaskulære natur20. Ideelt set bør den isolerede bageste øjenkop, der omfatter RPE, choroid og sclera, nedsænkes i vævsopbevaringsreagens inden for 5 minutter efter øjenenukleation for at sikre tilstrækkelig bevarelse af RNA i den indsamlede RPE-prøve.
SRIRS-metoden, som blev udviklet med det specifikke formål at indsamle prøver af RPE af høj kvalitet fra mus' øjne, synes at have nået dette mål for museøjne. Det rapporteres at være både effektivt og virkningsfuldt18. Denne teknik er også blevet anvendt med succes til at indsamle RPE fra raske menneskelige donorøjne21. Baseret på forfatternes erfaring er denne SRIRS-metode imidlertid ikke egnet til at indsamle RPE fra marsvinet, træspidsmusens og opossums øjne, selvom de underliggende årsager til dette ikke er klare. Ved at rapportere teknikken beskrevet her til at isolere og indsamle RPE fra øjnene på unge marsvin, håber vi at imødekomme et vigtigt udækket behov inden for nærsynethed.
Med hensyn til begrænsningerne i den beskrevne protokol er den vigtigste behovet for en periode med praktisk træning for at sikre effektiv indsamling af prøver, da tiden til færdiggørelse er nøglen ud over renheden af de indsamlede RPE-prøver. Forskere, der ikke har erfaring med okulær mikrodissektion eller kirurgi, vil have mest brug for træning. Selvom flere RPE-isolationsmetoder er rapporteret22,23, er metoden som beskrevet her ikke egnet til RPE-cellekulturer eller proteinanalyser på grund af brugen af et RNA-stabiliserende reagens.
RPE har længe været anerkendt for at spille kritiske roller, ikke kun for at opretholde nethindens sundhed og funktion, men også i relaterede sygdomme. Det faktum, at RPE nu også anerkendes for at spille en nøglerolle i regulering af okulær vækst og udvikling af nærsynethed, har udvidet omfanget af forskningsspørgsmål betydeligt, hvor evnen til at indsamle RPE-prøver af høj kvalitet fra enten marsvins øjne, som beskrevet her, eller andre pattedyr, der anvendes som dyremodeller, kan være nøglen til at give ny indsigt. Sådanne undersøgelser kan også give ny indsigt i de patologiske komplikationer af nærsynethed, herunder myopisk makulopati, hvor prævalenstallene kan forventes at stige parallelt med myopiprævalenstallene i sig selv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse støttes af Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (SG), en Loris og David Rich Postdoc (S.G.) og et tilskud fra National Eye Institute of the National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
