Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales
Summary
La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.
Abstract
En los organismos multicelulares, la programación del desarrollo y las respuestas ambientales pueden ser altamente divergentes en diferentes tipos de células o incluso dentro de las células, lo que se conoce como heterogeneidad celular. En los últimos años, el aislamiento de células individuales y de tipo celular combinado con técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han convertido en herramientas importantes para estudiar procesos biológicos a resolución de una sola célula. Sin embargo, aislar las células vegetales es relativamente más difícil debido a la presencia de paredes celulares vegetales, lo que limita la aplicación de enfoques unicelulares en las plantas. Este protocolo describe un procedimiento robusto para el aislamiento de células individuales y de tipo celular activado por fluorescencia (FACS) con células vegetales, que es adecuado para el análisis multiómico posterior y otros estudios. Usando líneas marcadoras fluorescentes de la raíz de Arabidopsis , demostramos cómo se aíslan tipos particulares de células, como las células periciclo del xilema-polo, las células iniciales de la raíz lateral, las células de la tapa de la raíz lateral, las células de la corteza y las células endodérmicas. Además, también se proporciona un método efectivo de análisis de transcriptoma aguas abajo utilizando Smart-seq2. El método de aislamiento celular y las técnicas de análisis del transcriptoma se pueden adaptar a otros tipos de células y especies de plantas y tienen un amplio potencial de aplicación en la ciencia de las plantas.
Introduction
Las células son la unidad fundamental de todos los organismos vivos y realizan funciones estructurales y fisiológicas. Aunque las células en organismos multicelulares muestran una aparente sincronicidad, las células de diferentes tipos y células individuales presentan diferencias en sus transcriptomas durante el desarrollo y las respuestas ambientales. La secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento (scRNA-seq) proporciona una potencia sin precedentes para comprender la heterogeneidad celular. La aplicación de scRNA-seq en ciencias de las plantas ha contribuido a construir con éxito un atlas celularvegetal 1, se ha utilizado para identificar taxones celulares raros en tejidos vegetales2, ha proporcionado información sobre la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales y se ha utilizado para identificar la identidad celular y las funciones importantes empleadas durante el desarrollo y la diferenciación de las plantas. Además, es posible inferir trayectorias de desarrollo espaciotemporal en tejidos vegetales 1,2,3 para descubrir nuevos genes marcadores4 y estudiar las funciones de importantes factores de transcripción5 utilizando scRNA-seq con el fin de revelar la conservación evolutiva del mismo tipo celular en diferentes plantas3. El estrés abiótico se encuentra entre las influencias ambientales más importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Al explorar los cambios en la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales bajo diferentes condiciones de tratamiento a través de la secuenciación del transcriptoma unicelular, también se puede resolver el mecanismo de respuesta al estrés abiótico6.
El potencial para resolver la heterogeneidad transcripcional entre los tipos de células mediante la secuenciación de scRNA depende del método de aislamiento celular y la plataforma de secuenciación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es una técnica ampliamente utilizada para aislar una subpoblación de células para scRNA-seq basada en la dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia de las células. El desarrollo de líneas marcadoras fluorescentes mediante tecnología transgénica ha mejorado considerablemente la eficiencia del aislamiento celular mediante el sistema de control de los datos sobre el terreno7. La realización de scRNA-seq utilizando Smart-seq28 mejora aún más la capacidad de diseccionar la heterogeneidad celular. El método Smart-seq2 tiene buena sensibilidad para la detección de genes y puede detectar genes incluso con una entrada de transcripción baja9. Además de la recolección masiva de tipos de células, los clasificadores de células modernos proporcionan un formato de clasificación de índice de una sola célula, lo que permite el análisis del transcriptoma a una resolución de una sola célula utilizando Smart-seq210 u otros métodos multiplexados de RNA-seq, como CEL-seq211. La clasificación de una sola célula o de tipo celular puede utilizarse potencialmente para muchas otras aplicaciones posteriores, como los estudios multiómicos paralelos12,13. Aquí se presenta un protocolo robusto y versátil para aislar tipos de células vegetales, como células periciclo xilema-polo, células de la tapa lateral de la raíz, células iniciales de la raíz lateral, células de la corteza y células endodérmicas de las raíces de las líneas celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. El protocolo implica además la construcción de la biblioteca Smart-seq2 para el análisis del transcriptoma aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo basado en Smart-seq2 puede generar bibliotecas de secuenciación fiables a partir de varios cientos de celdas8. La calidad del material de partida es esencial para la precisión del análisis del transcriptoma. FACS es una herramienta poderosa para preparar células de interés, pero este procedimiento, especialmente el paso de protoplasting , debe optimizarse para aplicaciones de plantas. La microdisección de captura láser (LCM) o las células diseccionadas manualmente también se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Establecimos este protocolo en la instalación multiómica unicelular de la Escuela de Agricultura y Biología de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, y contamos con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 32070608), el Programa Pujiang de Shanghai (Subvención No. 20PJ1405800) y la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Subvención No. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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