Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais
Summary
A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.
Abstract
Em organismos multicelulares, a programação do desenvolvimento e as respostas ambientais podem ser altamente divergentes em diferentes tipos celulares ou mesmo dentro das células, o que é conhecido como heterogeneidade celular. Nos últimos anos, o isolamento de célula única e do tipo celular combinado com técnicas de sequenciamento de próxima geração (NGS) tornaram-se ferramentas importantes para o estudo de processos biológicos em resolução de célula única. No entanto, o isolamento de células vegetais é relativamente mais difícil devido à presença de paredes celulares vegetais, o que limita a aplicação de abordagens unicelulares em plantas. Este protocolo descreve um procedimento robusto para o isolamento de células únicas e do tipo celular com células vegetais baseado em classificação celular ativada por fluorescência (FACS), que é adequado para análise multi-ômica a jusante e outros estudos. Usando linhas de marcadores fluorescentes de raízes de Arabidopsis , demonstramos como tipos celulares particulares, tais como células do periciclo xilema-pólo, células iniciais da raiz lateral, células da calota lateral da raiz, células do córtex e células endodérmicas, são isolados. Além disso, um método eficaz de análise do transcriptoma a jusante usando Smart-seq2 também é fornecido. O método de isolamento celular e as técnicas de análise do transcriptoma podem ser adaptados a outros tipos celulares e espécies vegetais e têm amplo potencial de aplicação na ciência vegetal.
Introduction
As células são a unidade fundamental de todos os organismos vivos e desempenham funções estruturais e fisiológicas. Embora as células em organismos multicelulares mostrem aparente sincronicidade, células de diferentes tipos e células individuais apresentam diferenças em seus transcriptomas durante o desenvolvimento e respostas ambientais. O sequenciamento de RNA de célula única de alto rendimento (scRNA-seq) fornece um poder sem precedentes para a compreensão da heterogeneidade celular. A aplicação de scRNA-seq em ciências vegetais tem contribuído para o sucesso na construção de um atlas celular vegetal1, tem sido usado para identificar táxons celulares raros em tecidos vegetais2, tem fornecido informações sobre a composição de tipos celulares em tecidos vegetais, e tem sido usado para identificar a identidade celular e funções importantes empregadas durante o desenvolvimento e diferenciação vegetal. Além disso, é possível inferir trajetórias espaço-temporais de desenvolvimento em tecidosvegetais1,2,3 para descobrir novos genesmarcadores4 e estudar as funções de importantes fatores detranscrição5 usando scRNA-seq, a fim de revelar a conservação evolutiva de um mesmo tipo celular em diferentesplantas3. Os estresses abióticos estão entre as influências ambientais mais importantes sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas. Ao explorar as mudanças na composição dos tipos celulares em tecidos vegetais sob diferentes condições de tratamento por meio do sequenciamento do transcriptoma de célula única, pode-se também resolver o mecanismo de resposta abiótica ao estresse6.
O potencial para resolver a heterogeneidade transcricional entre tipos celulares usando o sequenciamento de scRNA depende do método de isolamento celular e da plataforma de sequenciamento. A classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é uma técnica amplamente utilizada para isolar uma subpopulação de células para scRNA-seq com base no espalhamento de luz e nas propriedades de fluorescência das células. O desenvolvimento de linhagens de marcadores fluorescentes por tecnologia transgênica melhorou muito a eficiência do isolamento celular pelo FACS7. A realização de scRNA-seq usando Smart-seq28 aumenta ainda mais a capacidade de dissecar a heterogeneidade celular. O método Smart-seq2 tem boa sensibilidade para detecção de genes e pode detectar genes mesmo com uma baixa entrada de transcrito9. Além da coleta de tipos de células em massa, os classificadores de células modernos fornecem um formato de classificação de índice de célula única, permitindo a análise do transcriptoma em resolução de célula única usando Smart-seq210 ou outros métodos de RNA-seq multiplexados como o CEL-seq211. A classificação de célula única ou do tipo célula pode ser potencialmente usada para muitas outras aplicações a jusante, como estudos multi-ômicos paralelos12,13. Apresenta-se aqui um protocolo robusto e versátil para o isolamento de tipos celulares vegetais, tais como células periciclo xilema-pólo, células da calota lateral radicular, células iniciais da raiz lateral, células do córtex e células endodérmicas das raízes de linhagens celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. O protocolo envolve ainda a construção da biblioteca Smart-seq2 para análise do transcriptoma a jusante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo baseado em Smart-seq2 pode gerar bibliotecas de sequenciamento confiáveis a partir de várias centenas de células8. A qualidade do material de partida é essencial para a precisão da análise do transcriptoma. O FACS é uma ferramenta poderosa para o preparo de células de interesse, mas este procedimento, especialmente a etapa de protoplast, deve ser otimizado para aplicações em plantas. Microdissecção por captura a laser (LCM) ou células dissecadas manualmente também podem s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estabelecemos este protocolo na instalação multi-ômica de célula única da Escola de Agricultura e Biologia, Shanghai Jiao Tong University, e fomos apoiados pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 32070608), pelo Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e pela Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
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