Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.
In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.
Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zellulärer Taxa in Pflanzengeweben2 verwendet, hat Einblicke in die Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben geliefert und wurde verwendet, um die zelluläre Identität und wichtige Funktionen zu identifizieren, die bei der Entwicklung und Differenzierung von Pflanzen eine Rolle spielen. Darüber hinaus ist es möglich, räumlich-zeitliche Entwicklungsverläufe in Pflanzengeweben 1,2,3 abzuleiten, um neue Markergene4 zu entdecken und die Funktionen wichtiger Transkriptionsfaktoren5 mit Hilfe von scRNA-seq zu untersuchen, um die evolutionäre Konservierung desselben Zelltyps in verschiedenen Pflanzen aufzudecken 3. Abiotische Belastungen gehören zu den wichtigsten Umwelteinflüssen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Indem man die Veränderungen in der Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen durch Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung untersucht, kann man auch den abiotischen Stressreaktionsmechanismus aufklären6.
Das Potenzial für die Auflösung der transkriptionellen Heterogenität zwischen Zelltypen durch scRNA-Sequenzierung hängt von der Zellisolationsmethode und der Sequenzierungsplattform ab. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung einer Subpopulation von Zellen für scRNA-seq basierend auf Lichtstreuung und den Fluoreszenzeigenschaften der Zellen. Die Entwicklung von fluoreszierenden Markerlinien mittels transgener Technologie hat die Effizienz der Zellisolierung durch FACS7 erheblich verbessert. Die Durchführung von scRNA-seq mit Smart-seq28 verbessert die Fähigkeit, die zelluläre Heterogenität zu analysieren. Die Smart-seq2-Methode hat eine gute Sensitivität für den Gennachweis und kann Gene auch mit einem geringen Transkripteintrag nachweisen9. Zusätzlich zur Massenerfassung von Zelltypen bieten moderne Zellsortierer ein Einzelzell-Index-Sortierformat, das eine Transkriptomanalyse mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von Smart-seq210 oder anderen gemultiplexten RNA-seq-Methoden, wie z. B. CEL-seq211, ermöglicht. Die Einzelzell- oder Zellsortierung kann potenziell für viele andere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, z. B. für parallele Multi-Omics-Studien12,13. Hier wird ein robustes und vielseitiges Protokoll zur Isolierung von Pflanzenzelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, lateralen Wurzelkappenzellen, lateralen Wurzelinitialzellen, Kortexzellen und endodermalen Zellen aus den Wurzeln von Arabidopsis thaliana-Markerzelllinien mittels FACS vorgestellt. Das Protokoll beinhaltet außerdem den Aufbau der Smart-seq2-Bibliothek für die nachgelagerte Transkriptomanalyse.
Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch…
The authors have nothing to disclose.
Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.
0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
Betaine | yuanye | S18046-100g | |
Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
BSA | sigma | 9048-46-8 | |
CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
FACS | Sony | SH800S | |
Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
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KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
MES | aladdin | 145224948 | |
MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
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PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
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Vortex | Titan | VM-T2 |