ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.
באורגניזמים רב-תאיים, תכנות התפתחותי ותגובות סביבתיות יכולים להיות שונים מאוד בסוגי תאים שונים או אפילו בתוך תאים, מה שידוע בשם הטרוגניות תאית. בשנים האחרונות, בידוד תא בודד וסוג תא בשילוב עם טכניקות ריצוף הדור הבא (NGS) הפכו לכלים חשובים לחקר תהליכים ביולוגיים ברזולוציה של תא יחיד. עם זאת, בידוד תאי צמח הוא יחסית קשה יותר בשל נוכחותם של קירות תאי הצמח, אשר מגביל את היישום של גישות חד-תאיות בצמחים. פרוטוקול זה מתאר הליך חזק למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) המבוסס על בידוד תא בודד וסוג תא עם תאי צמחים, המתאים לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם ולמחקרים אחרים. באמצעות שימוש בקווי סמן פלואורסצנטיים של שורש Arabidopsis אנו מדגימים כיצד סוגי תאים מסוימים, כגון תאי פריסייקל של קוטב קסילם, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי כובע שורש רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים, מבודדים. יתר על כן, שיטת ניתוח תמלול יעילה במורד הזרם באמצעות Smart-seq2 מסופקת גם כן. שיטת בידוד התאים וטכניקות ניתוח התעתיק ניתנות להתאמה לסוגי תאים אחרים ולמיני צמחים ויש להן פוטנציאל יישום רחב במדעי הצמח.
תאים הם היחידה הבסיסית של כל האורגניזמים החיים ומבצעים פונקציות מבניות ופיזיולוגיות. למרות שהתאים באורגניזמים רב-תאיים מראים סינכרוניות לכאורה, תאים מסוגים שונים ותאים בודדים מציגים הבדלים בתעתיק שלהם במהלך ההתפתחות ובתגובות סביבתיות. ריצוף RNA חד-תאי בתפוקה גבוהה (scRNA-seq) מספק עוצמה חסרת תקדים להבנת הטרוגניות תאית. יישום scRNA-seq במדעי הצמח תרם לבנייה מוצלחת של אטלס תאי צמח1, שימש לזיהוי טקסים תאיים נדירים ברקמות צמח2, סיפק תובנה לגבי הרכב סוגי התאים ברקמות צמחים, ושימש לזיהוי זהות תאית ופונקציות חשובות המשמשות במהלך התפתחות והתמיינות צמחים. בנוסף, ניתן להסיק מסלולי התפתחות מרחביים-זמניים ברקמות צמחים 1,2,3 כדי לגלות גנים חדשים של סמן4 ולחקור את תפקודם של גורמי שעתוק חשובים5 באמצעות scRNA-seq כדי לחשוף את השימור האבולוציוני של אותו סוג תא בצמחים שונים3. עקה אביוטית היא בין ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גדילה והתפתחות של צמחים. על ידי חקירת השינויים בהרכב סוגי התאים ברקמות צמחים בתנאי טיפול שונים באמצעות ריצוף שעתוק חד-תאי, ניתן גם לפתור את מנגנון תגובת העקה הא-ביוטית6.
הפוטנציאל לפתרון הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים באמצעות ריצוף scRNA תלוי בשיטת בידוד התאים ובפלטפורמת הריצוף. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא טכניקה נפוצה לבידוד תת-אוכלוסייה של תאים עבור scRNA-seq בהתבסס על פיזור האור והתכונות הפלואורסצנטיות של התאים. פיתוח קווי סמן פלואורסצנטיים על ידי טכנולוגיה טרנסגנית שיפר מאוד את יעילות בידוד התאים על ידי FACS7. ביצוע scRNA-seq באמצעות Smart-seq28 משפר עוד יותר את היכולת לנתח את ההטרוגניות התאית. לשיטת Smart-seq2 יש רגישות טובה לזיהוי גנים והיא יכולה לזהות גנים גם עם קלט תעתיק נמוך9. בנוסף לאיסוף סוגי תאים בתפזורת, ממייני תאים מודרניים מספקים תבנית מיון אינדקס של תא יחיד, המאפשרת ניתוח תעתיק ברזולוציה של תא בודד באמצעות Smart-seq210 או שיטות RNA-seq מרובות אחרות, כגון CEL-seq211. מיון תא בודד או סוג תא יכול לשמש פוטנציאלית עבור יישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון מחקרי מולטי-אומיקה מקבילים12,13. מוצג כאן פרוטוקול חזק ורב-תכליתי לבידוד סוגי תאי צמחים, כגון תאי פריסייקל בקוטב קסילם, תאי כובע שורש רוחביים, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים משורשי קווי תאי סמן Arabidopsis thaliana על ידי FACS. הפרוטוקול כולל גם בניית ספריית Smart-seq2 לניתוח תמלול במורד הזרם.
הפרוטוקול מבוסס Smart-seq2 יכול ליצור ספריות רצף אמינות מכמה מאות תאים8. איכות חומר המוצא חיונית לדיוק ניתוח התמלול. FACS הוא כלי רב עוצמה להכנת תאים מעניינים, אך הליך זה, במיוחד השלב הפרוטו-מתמשך, חייב להיות מותאם ליישומים צמחיים. מיקרודיסקציה ללכידת לייזר (LCM) או תאים מנותחים ידנית י…
The authors have nothing to disclose.
הקמנו פרוטוקול זה במתקן הרב-תאי היחיד של בית הספר לחקלאות וביולוגיה, אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנחאי, ונתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ‘32070608), תוכנית שנחאי פוג’יאנג (מענק מס ’20PJ1405800), ואוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג (מענק מס ‘Agri-X20200202, 2019TPB05).
0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
Betaine | yuanye | S18046-100g | |
Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
BSA | sigma | 9048-46-8 | |
CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
FACS | Sony | SH800S | |
Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
MES | aladdin | 145224948 | |
MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
MS | Phytotech | M519 | |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A | ||
Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
Superscript enzyme (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
SuperScript VI buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
T0est tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
Vortex | Titan | VM-T2 |