Summary
Hier beschrijven we een op immunofluorescentie gebaseerde methode om de niveaus van enkelstrengs DNA in cellen te kwantificeren. Deze efficiënte en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om replicatiestress te onderzoeken, een gemeenschappelijk kenmerk bij verschillende eierstokkankers. Bovendien is deze test compatibel met een geautomatiseerde analysepijplijn, wat de efficiëntie verder verhoogt.
Abstract
Replicatiestress is een kenmerk van verschillende eierstokkankers. Replicatiestress kan voortkomen uit meerdere bronnen, waaronder dubbelstrengsbreuken, transcriptie-replicatieconflicten of versterkte oncogenen, wat onvermijdelijk resulteert in het genereren van enkelstrengs DNA (ssDNA). Het kwantificeren van ssDNA biedt daarom een kans om het niveau van replicatiestress in verschillende celtypen en onder verschillende DNA-beschadigende omstandigheden of behandelingen te beoordelen. Opkomend bewijs suggereert ook dat ssDNA een voorspeller kan zijn van reacties op chemotherapeutische geneesmiddelen die gericht zijn op DNA-reparatie. Hier beschrijven we een gedetailleerde immunofluorescentie-gebaseerde methodologie om ssDNA te kwantificeren. Deze methodologie omvat het labelen van het genoom met een thymidine-analoog, gevolgd door de op antilichamen gebaseerde detectie van het analoog bij het chromatine onder niet-denaturerende omstandigheden. Stukken ssDNA kunnen worden gevisualiseerd als foci onder een fluorescentiemicroscoop. Het aantal en de intensiteit van de foci houden direct verband met het niveau van ssDNA dat in de kern aanwezig is. We beschrijven ook een geautomatiseerde pijplijn om het ssDNA-signaal te kwantificeren. De methode is snel en reproduceerbaar. Bovendien maakt de eenvoud van deze methodologie het vatbaar voor toepassingen met een hoge doorvoer, zoals medicijn- en genetische schermen.
Introduction
Genomisch DNA wordt vaak blootgesteld aan meerdere aanvallen van verschillende endogene en exogene bronnen1. De frequentie van endogene schade correleert direct met de niveaus van metabole bijproducten, zoals reactieve zuurstofsoorten of aldehyden, die intrinsiek hoger zijn bij meerdere soorten kanker, waaronder eierstokkanker 2,3. Het is absoluut noodzakelijk dat DNA-schade efficiënt wordt opgelost; Anders kan het genotoxische laesies en bijgevolg mutagenese bevorderen. Het vermogen van cellen om genotoxische laesies te repareren is afhankelijk van de functionaliteit van foutloze DNA-reparatieroutes en de efficiënte regulatie van celcyclusprogressie als reactie op DNA-schade. Met name veel eierstokkankers dragen functioneel inactiverende mutaties in p53 en hebben dus een defect G1 / S-controlepunt, waardoor de cellen DNA-replicatie initiëren ondanks de aanwezigheid van niet-herstelde genomische laesies 4,5. De mate van DNA-schade bij eierstokkanker wordt verder verergerd door de observatie dat meer dan 50% van de hooggradige sereuze ovariumcarcinomen (HGSOC) defecten hebben in BRCA1- en BRCA2-gemedieerde homologe recombinatie, de foutloze DNA-reparatieroute, en ongeveer 20% heeft amplificatie in het gen CCNE1, dat G1-cellen voortijdig in de S-fase6 duwt . Samen verbeteren de hoge frequentie van endogene DNA-schade, defecte controlepunten en slecht functionerende reparatieroutes exponentieel de accumulatie van genomische laesies bij eierstokkanker. Deze laesies kunnen dienen als belemmeringen voor de progressie van kritieke cellulaire processen zoals DNA-replicatie en transcriptie. Zoals hieronder besproken, katalyseren dergelijke belemmeringen de generatie van enkelstrengs DNA (ssDNA) in cellen.
De dubbele helix van DNA is van cruciaal belang voor het beschermen van het genoom tegen meerdere mutagene processen, zoals spontane depurinatie en depyrimidinatie, de activiteit van cytosinedeaminasen en oxidatieve DNA-schade 1,7. Daarentegen is ssDNA zeer kwetsbaar voor deze mutatiegebeurtenissen. Meerdere processen in cellen kunnen resulteren in het genereren van ssDNA (figuur 1). Deze omvatten het volgende:
(i) Stilstand van de DNA-replicatiemachinerie: Dit leidt tot een ontkoppeling van de DNA-helicase en polymerase, waardoor stukken ssDNA 8,9 overblijven.
(ii) Stalling van de transcriptiemachinerie: Persistent stalling van RNA-polymerase leidt tot de generatie van driestrengs hybride DNA / RNA-structuren die R-lussen worden genoemd. R-lusvorming legt het verplaatste, niet-getranscribeerde DNA bloot als een enkele streng10.
(iii) DNA-eindresectie: Het initiëren van homologie-gericht herstel vereist het genereren van een 3' ssDNA om de zoektocht naar een homologe sequentie11 te katalyseren.
(iv) D-lus: Strenginvasie tijdens homologe recombinatie kan resulteren in de verplaatsing van de niet-template complementaire streng, resulterend in ssDNA12.
(v) Replicatie-gekoppelde hiaten: Tijdens DNA-replicatie vindt achterblijvende strengsynthese op een discontinue manier plaats, waarbij Okazaki-fragmenten eerst worden gegenereerd en vervolgens geligeerd. Een vertraging of defect in de verwerking van de Okazaki-fragmenten kan ook leiden tot ssDNA-vorming. Ten slotte, als de replicatievork op een leidende streng een stagnerende laesie, DNA-polymerase en primase tegenkomt, kan PRIMPOL de synthese stroomafwaarts herprimeren, waardoor een ssDNA-kloof achterblijft van13,14.
Het is duidelijk dat de meeste van deze gebeurtenissen plaatsvinden wanneer de DNA-replicatiemachinerie wordt geconfronteerd met genomische laesies of tijdens replicatie-gekoppelde reparatie, wat suggereert dat hogere DNA-schade leidt tot verhoogde niveaus van ssDNA. Omdat veel van deze gebeurtenissen replicatie-geassocieerd zijn, wordt de vorming van ssDNA beschouwd als de marker van "replicatiestress" in cellen15,16.
Hier beschrijven we een test die kan worden gebruikt om ssDNA in cellen betrouwbaar te kwantificeren. De eenvoud, reproduceerbaarheid en kostenvoordelen van deze aanpak maken het geschikt om te worden gebruikt voor het beoordelen van de replicatie-stressrespons in cellen. Opkomende studies hebben aangetoond dat het niveau van ssDNA ook een voorspeller kan zijn van reacties op chemotherapie, zoals remmers van PARP1/2-enzymen, ATR en Wee1-kinase 17,18,19,20,21. Deze remmers worden nagestreefd in het behandelingsregime van verschillende HGSOC's22. Daarom kan deze test ook een nuttig hulpmiddel zijn om chemotherapeutische reacties in eierstokkankercellen te voorspellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De cellijn van eierstokkanker, OVCAR3, werd in deze stappen gebruikt, maar dit protocol is breed toepasbaar op meerdere andere cellijnen, inclusief die afgeleid van niet-ovariële bronnen. Een schema van het protocol is weergegeven in figuur 2.
1. De cellen plateren
- Maak poly-L-lysine gecoate coverslips.
- Voeg geautoclaveerde coverslips met een diameter van 12 mm toe aan een conische buis van 50 ml met poly-L-lysine-oplossing en plaats deze gedurende 15 minuten op een wipstoel.
- Zuig de oplossing op in een weefselkweekkap. Was de coverslips door steriel water toe te voegen en plaats de tube met de coverslips gedurende 5 minuten terug op de rocker. Herhaal deze wasstap drie keer.
- Verdeel de gecoate dekzeilen op een steriele schaal en zuig eventueel achtergebleven water op. Laat de afdekplaten 1 uur drogen in de weefselkweekkap of totdat er geen waterdruppeltjes meer overblijven. Eenmaal droog, sluit de schaal af met parafilm en plaats op 4 °C.
- Plaats een poly-L-lysine-gecoate coverslip in elke put van een 24-well plaat. Het gebruik van poly-lysine coverslips is van cruciaal belang om te voorkomen dat de cellen losraken van de coverslips tijdens de pre-extractiestap.
- Trypsinize OVCAR3-cellen zodra ze 70% -80% confluency bereiken.
- Om een kweekschaal van 10 cm te trypsiniseren die 70% -80% confluent is, zuigt u het medium uit de plaat en wast u met 5-7 ml PBS.
- Zuig de PBS op, voeg 1 ml 0,25% trypsine toe en plaats de schaal in een incubator van 37 °C gedurende 8-10 minuten, of totdat cellen van de bodem van de plaat opstijgen.
- Verzamel de cellen met 5-10 ml medium en voeg toe aan een conische buis.
- Tel de cellen handmatig met een hemocytometer met behulp van standaardprocedures.
- Maak een verdunning van 25.000 cellen / ml en voeg 1 ml van de cellen toe aan poly-L-lysine coverslips geplaatst in de putten van 24-putplaten. Bepaal voor elke andere cellijn een getal zodanig dat de cellen ongeveer 70% -80% confluent zijn na drie populatieverdubbelingen.
- Kweek de cellen in het kweekmedium onder standaardomstandigheden.
2. Pulserende cellen met IdU
- Om de cellen goed te verspreiden op de dekzeilen, is één populatieverdubbeling voldoende. Na een populatieverdubbeling pulseert u de cellen met 10 μM 5-jood-2'-deoxyuridine (IdU) (zie tabel met materialen over hoe IdU te reconstitueren) voor de twee volgende populatieverdubbelingen.
OPMERKING: We hebben verschillende thymidine-analogen geprobeerd, waaronder bromodeoxyuridine (BrdU), 5-chloor-2′-deoxyuridine (CIdU) en IdU. Van de drie analogen geeft IdU de beste signaal-ruisverhouding. Vergelijkende beelden van cellen gepulseerd met de drie verschillende analogen zijn weergegeven in figuur 3. We raden het gebruik van twee negatieve controles aan: (i) een geen IdU gepulseerd monster en (ii) geen primaire antilichaamcontrole. Als de vorming van ssDNA moet worden beoordeeld als gevolg van een bepaalde behandeling, raden we aan het medicijn toe te voegen na de eerste ronde van IdU-verdubbeling. - Na het pulseren met IdU voor twee populatieverdubbelingen, oogst je de cellen voor beeldvorming.
- Vervang het medium door ijskoud 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) op ijs gedurende 5 min. Deze pre-extractiestap helpt cytoplasmatische en niet-chromatinegebonden eiwitten vrij te maken, waardoor chromatine-gebonden eiwitten intact blijven. Bepaalde cellijnen kunnen gemakkelijk afbladderen tijdens de pre-extractie. In een dergelijk scenario kan men 0,5% CSK-buffer gebruiken (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA en 0,5% Triton X-100).
3. Fixatie
- Zuig PBSTx aan en incubeer gedurende 15 minuten met 3% PFA (Table of Materials) bij kamertemperatuur, gevolgd door drie tot vier wasbeurten met 1x PBS. De vaste cellen kunnen tot verdere stappen op 4 °C worden gehouden.
LET OP: PFA is zeer giftig en kankerverwekkend. Vermijd contact met huid, ogen en slijmvliezen. Voer alle stappen uit met PFA in een zuurkast en gooi de materialen op de juiste manier weg.
4. Permeabilisatie en blokkering
- Permeabiliseer na fixatie de cellen met 0,5% PBSTx op ijs gedurende 5 minuten. Gebruik voldoende volume om de gehele coverslip te bedekken (meestal tussen 500 μL en 1 ml).
- Was de cellen drie tot vier keer met 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) op kamertemperatuur. Eén ml PBST is genoeg om elke put te wassen. Voer de wasbeurten rug aan rug uit zonder incubaties.
- Zuig de PBST aan en blokkeer de monsters met 5% BSA (Table of Materials) gemaakt in 1x PBS (blokkeringsbuffer) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
5. Immunostaining met het IdU-antilichaam
- Bereid voor immunostaining een bevochtigde kamer voor (nat keukenpapier op een Tupperware met platte bodem). Bedek het deksel van de 24-puts plaat met parafilm, plaats in de bevochtigde kamer en leg de afdekplaten op het plaatdeksel.
- Bereid het anti-BrdU primaire muisantilichaam (tabel met materialen) voor door het 1:200 te verdunnen in de blokkeringsbuffer uit stap 4.2.Het anti-BrdU-antilichaam is eerder aangetoond dat het IdU detecteert.
- Voeg 60 μL IdU-antilichaamverdunning toe aan de bovenkant van de coverslips. Incubeer de coverslips gedurende 1 uur bij 37 °C.
- U kunt ook minder antilichaamoplossing gebruiken als de coverslips worden omgedraaid op een druppel (20-25 μL) van 1:200 antilichaamverdunning die op parafilm is gepipetteerd. Dit vermindert ook de kans dat de oplossing uitdroogt tijdens de incubatie.
- Na de incubatie van 1 uur zuigt u het primaire antilichaam op. Breng de coverslips terug naar een plaat met 24 tanden en was ze vier keer met 0,2% PBST.
- Gebruik voor het secundaire antilichaam dezelfde bevochtigde kamer als beschreven in stap 5.1. Verdun antimuis geconjugeerd secundair antilichaam (tabel met materialen) in de blokkeringsbuffer (1:200). Voeg 60 μL secundair antilichaam toe aan de dekzeilen en incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.Dit secundaire antilichaam is lichtgevoelig.
- Zuig het secundaire antilichaam op. Breng de coverslips terug naar de 24-well plaat en was vier keer met 0,2% PBST.
- Label microscoopglaasjes en monteer de coverslips op de dia's met DAPI-montagemedium (Table of Materials). Bewaar dia's in het donker bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. De 24-uurs incubatie wordt aanbevolen als het montagemedium moet worden uitgehard of uitgehard.
OPMERKING: De dia's kunnen vervolgens in 4 °C worden bewaard voordat ze op een fluorescentiemicroscoop worden afgebeeld. Een representatief beeld is weergegeven in figuur 4.
6. Geautomatiseerde kwantificering van IdU-foci
OPMERKING: De kracht van deze test ligt in de mogelijkheid om de analyse te automatiseren voor een snelle en efficiënte kwantificering. We presenteren hier een geautomatiseerde analysepijplijn die kan worden gebruikt om IdU-foci in een bepaald afbeeldingsveld te kwantificeren. Het is belangrijk dat alle foto's binnen een bepaald experiment worden gemaakt met dezelfde belichtingsinstellingen; anders is de kwantificering niet betrouwbaar. Het kan ook waardevol zijn om een niet-gekleurde controle op te nemen als een negatieve controle, althans voor de eerste keer dat dit experiment wordt uitgevoerd (figuur 5). Het onderstaande protocol is specifiek voor NIS General Analysis Software, maar dezelfde principes kunnen ook worden toegepast met andere commerciële software.
- Ga op het tabblad Weergave naar Analysebesturingselementen | Analyse Explorer. Dit opent een nieuw zijvenster met de naam Analysis Explorer. Klik op Nieuwe maken | Algemene analyse 3. Hiermee opent u de software voor het maken van stroomdiagrammen in Analysis Explorer.
- Ga naar het tabblad Bronnen en sleep de opdracht Kanalen vanuit het linkermenu naar het werkgebied. De twee kanalen voor de DAPI- en IdU-foci verschijnen automatisch als binaire vakken (weergegeven in figuur 5 als vakken met rode contouren).
- Ga naar het tabblad Voorbewerking en sleep de opdracht Lokaal contrast van het linkermenu naar het werkgebied. Verbind het lokale contrast met het IdU-focikanaal. Sleep vanaf het tabblad Segmentatie de opdracht Drempel (één voor elk kanaal).
- Verbind elk kanaal met een threshold-opdracht. Als u kernen aan de rand van een afbeelding wilt verwijderen, gaat u naar het tabblad Binaire verwerking , sleept u de opdracht Randen aanraken en maakt u verbinding met de DAPI-drempel.
- Voeg de gegevens van de twee kanalen samen met de opdracht Onderliggende elementen aggregeren op het tabblad Meting . Definieer het DAPI-kanaal als Bovenliggend (A) en het foci-kanaal als Onderliggend (B). Selecteer in het vervolgkeuzemenu in de opdracht Kinderen aggregeren de optie kind bevindt zich in de bovenliggende entiteit. Deze stap helpt bij het tellen van het aantal foci (kind) per kern (ouder).
- Als u de gegevens in tabelvorm wilt exporteren, klikt u op de opdracht Kolommen wijzigen op het tabblad Gegevensbeheer . Selecteer in het vervolgkeuzemenu van de opdracht Kolommen wijzigen DAPI-ID (dit helpt om een uniek nummer toe te wijzen aan elke kern binnen een bepaalde afbeelding) en IdU-telling (dit geeft het aantal IdU-foci in elke kern weer). Als u de gegevens in een CSV-indeling wilt exporteren, gebruikt u de opdracht Tabel naar CSV-bestand op het tabblad Verwijzing . De GA3 kan nu worden opgeslagen met een beschrijvende titel.
- Open voor de analyse een afbeelding in de software.
- Open het tabblad Analyseverkenner zoals in stap 6.1 is gedaan en zoek de zojuist gemaakte GA3. Dubbelklik op het GA3-bestand, dat een nieuw venster opent met de naam GA3 Wizard , waar men de drempel voor de DAPI- en de IdU-kanalen kan instellen.
- Gebruik de schuifregelaar in het venster om de minimum- en maximumdrempel voor elk kanaal in te stellen en zo het signaal te definiëren. Een goede drempelwaarde is waar de grenzen voor elke kern en IdU-focus duidelijk zijn gedefinieerd. Zodra u tevreden bent met drempelwaarden, behoudt u deze getallen voor het analyseren van alle bestanden in een bepaald experiment.
- Klik op de knop Uitvoeren om het aantal IdU-foci/per kern te verkrijgen.
OPMERKING: De software genereert een tabel met foci per kern, die vervolgens kan worden gebruikt voor grafische doeleinden (figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden en de kwantificering van IdU-foci van de kernen afkomstig van de onbehandelde cellen en cellen behandeld met 0,5 mM hydroxyureum gedurende 24 uur zijn weergegeven in figuur 4. Beide kernen zijn gekleurd en identificeerbaar in het DAPI-kanaal. De analyse van deze beelden bestaat uit het kwantificeren van het aantal foci in elke kern. Het aantal foci is evenredig met de mate van replicatiespanning.
Figuur 1: Mechanismen van ssDNA-generatie. Schematisch om verschillende mechanismen te laten zien waarmee ssDNA in de cel kan worden gegenereerd. Dit omvat (A) het afslaan van de replicatiemachines, (B) het afslaan van de transcriptiemachines, resulterend in R-lussen, (C) DNA-eindresectie, (D) de vorming van D-lussen, of (E) replicatie-gekoppelde hiaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: IdU-etiketteringsschema. Cellen worden gepulseerd met IdU voor twee populatieverdubbelingen. Als een medicamenteuze behandeling nodig is, moet deze worden toegediend nadat de eerste populatie is verdubbeld in aanwezigheid van IdU. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van het foci-signaal verkregen na pulseren met IdU, BrdU of CldU. Representatieve beelden van cellen gepulseerd met drie verschillende thymidine-analogen. De DAPI, GFP (die Alexa-488-gelabelde IdU-foci vertegenwoordigt) en samengevoegde kanalen worden weergegeven. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verhoogde IdU-foci in OVCAR3-cellen veroorzaakt door replicatiestress . (A) Representatieve Idu- en DAPI-gekleurde kernbeelden en (B) kwantificering van de cellen behandeld met 0,5 mM hydroxyureum gedurende 24 uur. **** p < 0,0001 (Mann-Whitney-test). Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve geautomatiseerde analyse GA3-pijplijn. Ga3 geautomatiseerde analyse kan worden uitgevoerd door een pijplijn te genereren om de kernen te drempelen op basis van DAPI (weergegeven in oranje) en IdU-foci (weergegeven in geel). Het aggregeren van deze twee drempels vult het aantal IdU-foci per kern. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals vermeld in het protocol, is het waardevol om een paar experimentele controles op te nemen om ervoor te zorgen dat de test werkt. Deze omvatten een geen IdU behandeld monster en een geen primair antilichaam behandeld monster. Beide negatieve controles moeten cellen opleveren die zijn gekleurd door DAPI, maar geen IdU-signaal bevatten.
Op basis van de experimentele omstandigheden en de gebruikte cellijnen kunnen verschillende antilichaamverdunningen nodig zijn om het beste fluorescerende signaal te verkrijgen. Te veel signaal kan resulteren in een onvermogen om individuele foci te kwantificeren, terwijl te weinig signaal kan betekenen dat experimentele verschillen tussen de monsters niet kunnen worden geïdentificeerd. Het aanpassen van de pre-extractie- en permeabilisatietijden kan ook helpen als er te veel achtergrondsignaal is, dat kan voortvloeien uit niet-geëxtraheerde nucleoplasmatische inhoud.
Aangezien dit protocol IdU-opname over twee populatieverdubbelingen vereist, is het belangrijk om rekening te houden met de verdubbelingstijd van elke cellijn. Bij het vergelijken van twee cellijnen met verschillende verdubbelingstijden, is het noodzakelijk om de lengte van de IdU-pulsering aan te passen aan de verdubbelingstijd van elke cellijn. Dit kan echter een zekere mate van variatie introduceren. De toepassing van deze test is dus het meest effectief bij het vergelijken van cellijnen met vergelijkbare verdubbelingstijden. Als de verdubbelingstijden niet bekend zijn, kan dit voorafgaande experimentele optimalisatie vereisen.
Bovendien kan deze test de hoeveelheid ssDNA onderschatten die op een bepaald moment in de cel aanwezig is. ssDNA is alleen identificeerbaar als foci wanneer de tegenovergestelde streng is gelabeld met IdU. Dus als de streng tegenover het ssDNA niet is gelabeld, wordt deze niet gedetecteerd. Als het ouderlijk niet-gelabelde DNA bijvoorbeeld laesies heeft die aanleiding geven tot hiaten, zullen die laesies niet worden gedetecteerd (figuur 2). Voor een meer gevoelige analyse zou een alternatieve benadering zijn om de cellen te onderzoeken op replicatie-eiwit A (RPA). RPA is een DNA-bindend eiwit dat bij voorkeur ssDNA bedekt om te voorkomen dat het secundaire structuren vormt en beschermt tegen nucleaseactiviteit23,24. Tijdens replicatie-gekoppelde schade wordt RPA gefosforyleerd bij serine 33, en daarom kan pRPA S33 worden gebruikt als een marker voor replicatiestress. Onder omstandigheden van overmatige schade wordt pRPA S33 verder gefosforyleerd op S4/S8 door DNA-PK25. Door verschillende vormen van RPA te onderzoeken die aan het chromatine zijn gebonden, kan men dus verschillende replicatiestressreacties in cellen beoordelen. Deze twee complementaire benaderingen (IdU-foci en RPA-kleuring) kunnen parallel worden uitgevoerd om de niveaus van ssDNA te valideren met behulp van verschillende methodologieën.
Deze test biedt een eenvoudig te volgen, zeer reproduceerbare en efficiënte methode om ssDNA in een bepaald celtype te kwantificeren. Het kan worden aangepast om de toepassing van verschillende medicamenteuze behandelingen, verschillende celtypen en meerdere analysetools mogelijk te maken. Het is vatbaar voor verschillende geautomatiseerde kwantificeringsmethoden, waaronder de NIS-analysesoftware. In tegenstelling tot andere technieken om ssDNA te kwantificeren, zoals de COMET-gebaseerde assay, is de IdU foci assay meer haalbaar voor high-throughput toepassingen.
Deze test kan worden gebruikt voor een veelheid aan toepassingen. Een verhoogde aanwezigheid van ssDNA kan worden gebruikt als een marker van replicatiestress en voor het voorspellen van chemotherapieresponsen bij verschillende eierstokkankers. Bovendien kan de versterking van oncogenen waarvan bekend is dat ze de replicatie of celcyclusregulatie verstoren, de accumulatie van laesies veroorzaken die resulteren in een verhoogd ssDNA. Deze test zou daarom ook kunnen worden gebruikt om het effect te onderzoeken dat de amplificatie van oncogenen heeft op de accumulatie van ssDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
PV wordt ondersteund door de Inaugural Pedal the Cause Grant van het Alvin J. Siteman Cancer Center via The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant van Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant van Mary Kay Ash Foundation en V-Foundation. NR wordt ondersteund door de NIH Cell and Molecular Biology training T32-beurs aan de Washington University, St. Louis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive - keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
References
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A.
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
